卵子能够100%重编程已经定向分化的精子细胞核,但不能完全重编程体细胞核。作为供核细胞,二者的显著区别是:体细胞没有端粒酶活性,精子细胞的端粒酶活性存在时序性变化。基于此,本研究拟通过腺病毒携带端粒酶基因制备牛乳腺细胞体外研究模型,命名hTERT-bMGEs,它可以模拟精子细胞成熟过程端粒酶活性的变化,以hTERT-bMGEs为供核细胞,探究当供核细胞端粒酶活性发生类似精子细胞成熟过程的变化时,其表观修饰变化是否接近正常受精胚,卵子是否能提高体细胞重编程效率?本研究目的是通过阐明供体细胞端粒酶时序性变化与体细胞核重编程的互作机制,为体细胞重编程的理论及应用研究提供一种新思路。相关研究与结果如下:1.利用重组腺病毒AdEasy-1体系构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的腺病毒载体,分别用电转法、脂质体法进行转染,并结合不同的血清浓度包装293A细胞进行病毒包装条件的优化,进一步通过感染体外分离培养的小鼠成纤维细胞验证端粒酶是否能够成功表达。结果表明,携带hTERT基因的重组腺病毒载体构建成功,其病毒包装最优条件是:脂质体法+15%(v/v)的胎牛血清,由此获得病毒滴度最高达1×1011IFU/mL;进一步通过RT-PCR和荧光检测证实端粒酶基因在小鼠成纤维细胞中能够成功表达,可用于后续制备牛乳腺细胞体外研究模型。2.体外分离纯化牛乳腺上皮细胞并进行生物学特征的鉴定。结果表明:首次尝试一种“二次选择性组织块贴壁法”进行乳腺上皮细胞分离纯化,其获得的乳腺细胞纯度为100%,细胞活力较好,且在体外能稳定维持乳腺上皮细胞的正常生物学特性,进一步发现此方法获得的单克隆显著多于对照组。本研究为乳腺细胞体外研究模型的建立提供了一个有效的方法。3.利用携带端粒酶基因的重组腺病毒感染牛乳腺上皮细胞,筛选阳性细胞并进行鉴定。结果表明:成功制备牛乳腺细胞体外研究模型hTERT-bMGEs,且通过比较携带端粒酶基因的质粒载体pCI-neo-hTERT和pEGFP-hTERT与腺病毒载体的转染效率和阳性克隆率,表明腺病毒转染效率显著高于质粒载体,是制备细胞研究模型的最适途径。4.以精子细胞为对照,通过对阳性细胞端粒酶活性分析,筛选出最适模型制作体细胞克隆胚,通过对克隆胚卵裂率、囊胚发育率和X染色体失活、印记基因H19、IGF2表达量的检测与分析,探究端粒酶活性对体细胞重编程效率及表观遗传修饰的影响。结果表明:第13代hTERT-bMGEs为核移植的最适供核模型,获得的克隆胚卵裂率和囊胚发育率显著虽显著低于体外受精胚,但显著高于非转端粒酶基因的供核细胞获得的克隆胚,且hTERT-bMGEs组获得4-细胞期克隆胚印记基因H19、IGF2和X染色体失活相关基因XIST的表达量均显著低于对照组;初步结果表明当供核细胞端粒酶活性发生类似精子细胞成熟过程的变化时,卵子能够提高体细胞重编程效率。