植物在生长发育过程中经常面临多种病原物威胁,为应对胁迫,它们在长期进化过程中演化出多种精妙的抗病调控路径,包括促分裂原活化蛋白激酶级联信号通路以及激素信号转导通路的激活,体内活性氧的爆发与清除,病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)的表达等。植物非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,ns LTPs)是一类广泛且大量存在的碱性小分子蛋白,属于PR家族。研究表明,该类蛋白在植物抗病防御过程中发挥重要作用。马铃薯(Solanum tuberosum)是世界第四大重要的粮食作物,其生长和品质经常面临病害的严重威胁。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引发的晚疫病是马铃薯生产中常见的毁灭性病害。因此,挖掘和利用优良抗性基因用于培育优质、高产和抗病的马铃薯新品种尤为重要。迄今为止,有关马铃薯ns LTPs在抗病调节中的功能及其作用机理的研究鲜有报道。本研究,从马铃薯中筛选到一个受晚疫病菌诱导且表达显著上调的ns LTP家族基因St LTP10,并对其在植物抗病过程中的功能及分子机理进行研究,主要结果和结论如下:(1)St LTP10受晚疫病菌和多种胁迫相关激素的诱导。诱导表达模式分析显示,St LTLP10除了能够响应晚疫病菌侵染之外,还受脱落酸,水杨酸,茉莉酸等多种胁迫相关激素的显著诱导,暗示St LTP10可能在植物胁迫应答过程中发挥重要作用。(2)St LTP10在进化上高度保守。St LTP10蛋白含有8个保守的半胱氨酸残基以及2个保守的五肽结构域,其N端前24个氨基酸为信号肽序列。另外,马铃薯St LTP10与番茄Lp LTP1高度同源。(3)St LTP10正调控植株对晚疫病菌的抗性。为鉴定St LTP10在植物抗病方面的功能,在本生烟叶片中异源超表达St LTP10之后,离体接种晚疫病菌,发现超表达St LTP10叶片的抗病能力较对照显著提高;利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术介导马铃薯植株中St LTP10基因表达沉默,随后接菌进行抗病性分析,结果显示St LTP10沉默株系的抗病能力较对照显著下降;采用农杆菌介导的茎段转化法分别获得稳定的St LTP10超表达(St LTP10-OE)和RNAi干扰下调表达(St LTP10-RNAi)转基因马铃薯株系,抗病性分析结果显示,St LTP10-OE以及St LTP10-RNAi转基因株系分别表现为抗病和易感表型。综上表明,马铃薯St LTP10正调控植株对晚疫病菌的抗性。(4)St LTP10增强活性氧清除能力以及防御相关基因的表达。活性氧清除途径和抗病相关基因的表达调控在植物抵御病原菌入侵以及增强植株自身抗性方面发挥重要作用。为探究St LTP10对植株抗病性的正向调控是否与这两条途径有关,DAB及NBT染色分析发现,病原菌侵染后的St LTP10-OE植株叶片活性氧积累量明显少于对照,而St LTP10-RNAi植株叶片则表现出相反表型;q RT-PCR定量检测显示,St LTP10-OE植株中活性氧清除以及抗病防御相关基因的表达量较对照普遍上调。这表明St LTP10超表达植株对晚疫病菌抗性的增强可能与活性氧清除能力以及抗性相关基因表达水平的提高有关。(5)St LTP10招募ABA受体PYL4至质膜。为解析St LTP10调控植株抗病的机理,以p GBKT7-St LTP10为诱饵进行酵母文库的筛选,成功钓取到ABA受体pyrabactin resistance-like 4(PYL4)。随后,分别利用酵母双杂交、双分子荧光互补与荧光素酶互补实验以及pull-down技术对两者的互作关系进行了验证。为明确两者互作的意义,对两个蛋白的亚细胞定位进行分析,发现PYL4-GFP单独表达时的荧光信号主要定位于胞质;而St LTP10与PYL4-GFP共表达时,GFP荧光信号虽在局部胞质内仍有定位,但质膜区域信号显著增加。另外,膜质分离后PYL4蛋白含量检测结果与上述观察结果相符,说明St LTP10能够影响PYL4在质膜上的定位。(6)St LTP10正调控ABA信号途径。有研究报道,质膜定位的ABA受体在早期ABA信号感知与转导过程中发挥重要作用。为检验St LTP10是否通过影响PYL4质膜定位进而影响ABA信号通路,q RT-PCR定量检测发现,ABI3、ABI5、RAB18等ABA信号下游关键基因在St LTP10-OE株系中表达上调,且ABA介导的根生长抑制现象在St LTP10-OE株系中较对照更加明显,说明St LTP10正调控ABA信号途径。(7)St LTP10协同PYL4正调控病原菌触发的气孔关闭。病原菌侵染初期,ABA诱导的气孔关闭在抵御病原菌入侵方面发挥关键作用。为鉴定St LTP10是否参与调控ABA介导的气孔关闭,利用ABA喷施处理不同遗传背景的马铃薯植株叶片,观察气孔运动情况,结果表明,St LTP10促进ABA诱导的气孔关闭。为进一步明确St LTP10能否在病原菌入侵后促进叶片气孔关闭,利用晚疫病菌喷施接种以上植株叶片,随后对气孔孔径进行测量,发现St LTP10-OE植株叶片气孔开度较WT明显减小,而St LTP10-RNAi植株叶片气孔孔径显著大于WT,证实St LTP10正调控病原菌入侵后的气孔关闭。为探究PYL4在St LTP10调控气孔关闭过程中的作用,利用VIGS技术分别获得PYL4表达沉默株系,随后对不同种遗传材料叶片接菌,进行气孔开度分析,发现St LTP10-RNAi1与TRV2::PYL4植株叶片表现出相似的气孔关闭受抑制现象;TRV2::PYL4/St LTP10-OE1与TRV2::PYL4/St LTP10-RNAi1植株叶片气孔关闭受抑制程度与以上两者相比均无明显差别。综上表明,St LTP10协同PYL4正调控病原菌触发的气孔关闭。(8)WIPK磷酸化St LTP10并维持其蛋白稳定性。为进一步解析St LTP10参与调控植株抗病的完整通路,同样以p GBKT7-St LTP10为诱饵进行互作蛋白的筛选,并找到一个快速响应晚疫病菌处理的MAPK家族成员wound-induced protein kinase(WIPK)。抗病性分析结果显示,WIPK能够协助St LTP10进一步增强叶片对晚疫病菌的抗性。体外激酶实验证明,WIPK能够直接磷酸化St LTP10。体外以及体内蛋白降解实验表明,WIPK能够维持St LTP10的蛋白稳定性。上述结果表明,WIPK可能通过磷酸化作用来稳定St LTP10蛋白的表达,从而参与调控植株对病原菌的抗性。综上所述,马铃薯St LTP10能够通过减轻氧化胁迫以及提高抗病相关基因的表达水平来增强植株对晚疫病菌的抗性。深入研究表明,St LTP10与ABA受体PYL4以及MAPK级联成员WIPK互作。一方面,St LTP10通过影响PYL4质膜定位,正调控ABA信号;且在病原菌入侵初期,St LTP10协同PYL4正调控叶片气孔关闭。另一方面,WIPK通过磷酸化St LTP10来维持其蛋白稳定性,从而增强St LTP10调控植株抗病的能力。这是马铃薯中首次将MAPK级联通路、ABA信号途径以及ns LTP结合起来的研究,具有重要的理论指导及借鉴意义。