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目的通过自行研制的短波紫外线(UVC)灭活装置研究短波紫外线对血小板悬液中指示病毒(辛德毕斯病毒和伪狂犬病毒)灭活的实验方法,以期在保护血小板功能质量前提下提高血小板的安全性。方法1、血小板病毒灭活方法的建立(1)富血小板血浆(PRP)的制备:采用白膜法分离血小板。用400ml的一次性采血袋采集健康献血员静脉血,边采集边缓慢混匀,以免血液凝集或溶血。采血完成后将血袋置于低温离心机中,调节温度22±2℃,离心转速为4000rpm,离心10min。离心结束后用全血成分分离机分离出白膜成分。白膜经第二次离心,转速为800rpm,离心10min后用夹板手工分离出血袋上层淡黄色的富血小板血浆,置22±2℃振荡保存。(2)血小板的病毒灭活:试验前先配制好血小板添加剂SSP+盐溶液备用。首先取1袋手工血小板,先经3000rpm,20min离心去除上层血浆,然后加入配制好的SSP+溶液混匀,重悬血小板。再加入1/10体积的指示病毒(辛德毕斯病毒或伪狂犬病毒)和核黄素磷酸钠溶液混匀,制得含有指示病毒的血小板悬液,使核黄素磷酸钠工作浓度约200 μM。最后,向长宽约14cm×5cm的光照袋中加入20ml血小板SSP+悬液,使其液层厚度约3mm。置于自制的UVC灭活仪中进行紫外线照射0,15s,30s,1min,2min。每一时间点照射结束后,留取0.5ml样本做病毒滴度检测。(3)血小板病毒灭活效果检测:选用病毒敏感的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞株)接种于96孔板中,采用微量细胞病变法。将上述经紫外线辐照前后的样品做10倍系列稀释后,立即加入已接种检测细胞的96孔板中,每个稀释度做8复孔,放37℃,5%CO2培养箱中孵育72小时,光镜下观察并记录细胞病变(CPE)情况,计算TCID50。2、病毒灭活处理后血小板功能检测(1)血小板计数:用血细胞计数仪测定病毒灭活处理前后血小板计数(PLT)。(2)血小板活化后生长因子释放量的检测:VEGF、PDGF-BB、TGF-β、IGF、bFGF和EGF六种生长因子,用ELISA试剂盒进行定量检测,实验操作严格按照试剂盒说明书进行。(3)血小板活化上清促细胞增殖试验:选用CCK-8法检测病毒灭活前后血小板活化上清对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的促进作用。调整细胞计数约5× 104个/ml,铺96孔板,待细胞贴壁后进行给药。根据生长因子含量检测结果,选择稀释320倍的血小板活化上清(用含0.4%胎牛血清的1640培养基稀释),每个标本3复孔,每孔100 μ 1。阴性对照孔吸去培养基后加入0.4%胎牛血清的1640培养基。培养24h,48h,72h后每孔加入10 μ 1的CCK-8试剂,放入37℃C 5%C02培养箱中2个小时后,在主波长570nm,次波长630nm的双波长下测吸光度值。通过吸光度值的比较判断细胞增殖的情况。(4)血小板超微结构观察:取2ml血小板样品,以8000×g离心2min,去上清,PBS洗涤2次,加入3%戊二醛4℃下固定交由本院医学实验科做超薄切片,透射电子显微镜下观察血小板的超微结构。结果1、非洲绿猴肾细胞在含10%胎牛血清的MEM培养基中生长状态良好,4h可见部分细胞贴壁,逐渐伸出伪足;24h细胞完全贴壁,边界清楚,为长梭形;2-3d融合成致密单层,为铺路石样排列,细胞生长较快。在感染伪狂犬病毒/辛德毕斯病毒24h即可出现镜下可见的细胞病变效应,细胞肿胀变圆,折光性变强,可见合胞体,并逐渐脱落。2、自制的短波紫外线(UVC)灭活装置对血小板病毒灭活效果显著。在单面辐照强度为4.32mw/cm2,单独紫外线光照处理30s即能有效灭活血小板悬液中的辛德毕斯病毒和伪狂犬病毒,使病毒滴度降低4个对数级(［og)。照射lmin,可使伪狂犬病毒全部灭活(下降5.38个对数级),辛德毕斯病毒全部灭活(下降4.59个对数级)。在辐照剂量相同的条件下,单独UVC处理组和添加核黄素磷酸钠组两组病毒灭活效果没有显著差异。3、在病毒灭活处理后血小板功能评价方面,UVC处理后血小板计数明显下降,P<0.05;在辐照剂量相同的条件下,添加核黄素磷酸钠组血小板计数降低较无核黄素磷酸钠组降低缓慢,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。并且在病毒灭活处理30s,血小板活化上清中,除TGF-β外其余五种生长因子,处理组较未处理组明显降低,P<0.05,有统计学差异;TGF-β在UVC处理后升高,P<0.05,差异有统计学意义。在细胞增殖实验中,处理前后的血小板活化上清均有促细胞增殖的作用;在第24h新鲜未处理组PRP活化上清对细胞增殖作用最强,P<0.01;在第48h和第72h单独UVC处理组PRP活化上清对脐静脉内皮细胞增殖作用最强,P<0.01。电镜结果发现处理组血小板伪足伸出,细胞肿胀,内容物释放。结论短波紫外线UVC法可有效灭活血小板悬液中辛德毕斯病毒和伪狂犬病毒,在短时间内使病毒滴度均降低4个对数级以上,达到了国家对血液制品病毒灭活的要求;在此灭活体系中添加核黄素磷酸钠对病毒灭活并无明显促进作用,但对血小板的质量和功能有一定的保护作用。UVC照射灭活病毒的同时会损伤血小板,使血小板数量降低、结构有一定程度破坏等,是下一步研究中需要解决的问题。