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研究背景与目的:弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)是指头部遭受钝性外力作用后所产生以脑白质的轴索弥漫性损伤为主要特征的一种脑损伤。由于DAI以脑白质的轴索弥散性损伤为主要特征,缺乏明确的神经系统损害定位体征以及影像学改变,尸检仅凭宏观及一般组织学检查不易诊断,因而DAI是法医学鉴定中面临的一大难题。在损伤诊断和损伤机制研究中,蛋白质和多肽是最常见也是最有效的生物标志物。然而,目前关于DAI的生物标志物十分匮乏,缺乏系列全面的研究。随着人类基因组计划的逐步完成,科学家们开始对基因组表达调控与蛋白质功能进行研究,进一步提出蛋白组计划。对于发现新型的生物标志物和药物,蛋白质组学已经成为非常重要的手段,在临床、基础医学等领域有着非常广泛的应用,也为人类的健康有着很大贡献。近年来,基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight imaging mass spectrometry,MALDI-TOF IMS)技术已成功用于直接分析生物组织切片,作为一项崭新的技术,能够同时绘制组织切片中成百上千个多肽和蛋白的二维质谱图像。MALDI-TOF IMS技术已广泛用于生理和病理组织中蛋白质的表达以及其它分子标志物的发现。以蛋白质组学的方法通过MALDI-TOF IMS技术来识别和筛选生物标志物,能够从整体分析组织的蛋白表达谱,有望发现一系列相关的蛋白质或多肽代替单一分子标志物,以达到DAI早期诊断的目的。方法:DAI动物模型建立和差异蛋白的筛选:参考相关文献制作自由落体打击装置,建立大鼠弥漫性轴索损伤模型,设立大鼠DAI组和对照组,分别取大鼠大脑皮质、大脑髓质、小脑及脑干组织冰冻切片进行MALDI检测,运用布鲁克公司开发的ClinProTools 2.2软件对采集的图谱进行数据分析,获取DAI组织和正常组织的全部蛋白指纹图谱,经统计学分析,初步筛选出DAI大鼠脑组织中特异性表达的蛋白质。DAI组和对照组差异蛋白的质谱成像:参考文献建立DAI大鼠模型,设立DAI组和对照组,获取大鼠脑组织冰冻切片后进行MALDI检测,采集质谱数据,并进行统计学分析,得到两组的差异蛋白,并对差异蛋白进行质谱成像,得到大鼠大脑、小脑、脑干组织切片中差异蛋白的二维分布图像,观察不同的差异蛋白在大脑、小脑及脑干中的分布。实验大鼠DAI诊断模型的建立:参考文献建立DAI大鼠模型,设立DAI组和对照组,将大鼠脑干组织的冰冻切片进行MALDI检测,采集两组的质谱数据,并将两组的质谱数据导入ClinProTools 2.2软件进行统计学分析,运用Supervised Neural Network(SNN)算法建立统计模型,将结果导入 FlexImaging 3.0软件,直接在组织切片上进行成像,将DAI诊断模型可视化,并将诊断模型进行验证。结果:差异蛋白筛选结果:将DAI组和对照组的大鼠脑组织的质谱数据导入ClinProTools 2.2软件进行统计学分析后,通过筛选得到大脑皮质60个差异表达的蛋白质(P<0.05),其中有50个在DAI组中表达上调,10个表达下调;大脑髓质56个差异表达的蛋白质(P<0.05),其中有46个在DAI组中表达上调,10个表达下调;小脑65个差异表达的蛋白质(P<0.05),其中有33个在DAI组中表达上调,32个表达下调;脑干61个差异表达的蛋白质(P<0.05),其中有52个在DAI组中表达上调,9个表达下调。质谱成像结果:利用MALDI-TOF IMS采集DAI组和对照组图谱数据,并进行统计学分析后,得到两组的差异蛋白,挑选5个特异性表达的蛋白质在脑组织切片上进行质谱成像,分别为M4963.30Da、M5634.78Da、M6253.65Da、M6714.37Da和M7532.87Da。与对照组相比,M4963.30Da在DAI组小脑中表达减少,在大脑皮质、髓质及脑干中表达增多;M5634.78Da在DAI组大脑皮质及髓质中表达量减少,在小脑和脑干中表达量增多;M6253.65Da在DAI组大脑皮质、髓质及小脑中表达减少,在脑干中表达增多;M6714.37Da在DAI组大脑皮质、髓质及小脑中表达减少,在脑干中表达增多;M7532.87Da在DAI组大脑髓质中表达减少,在大脑皮质、小脑及脑干中表达增多。建立诊断模型结果:将DAI组和对照组的大鼠脑组织的MALDI检测结果导入ClinProTools 2.2软件,并利用SNN算法运算和FlexImaging 3.0软件成像后,得到DAI大鼠诊断模型。诊断模型分为红色和绿色两种颜色,分别代表DAI组和对照组。SNN算法选取了 13个具有特异性表达的蛋白质分子进行建模,特异性较高的蛋白质分子有4个,M7059.21Da和M1518.33Da在DAI组中高表达,而M5077.03Da和M4327.20Da的在对照组中高表达。诊断模型经过验证后,得到整体的交叉验证能力为95.67%,敏感性为99.34%,特异性为92.01%。结论:MALDI-TOF IMS可用于DAI组和对照组大鼠脑组织差异蛋白的筛选,得到上调或下调的差异蛋白质。通过不同质荷比的蛋白质分子进行质谱成像,可立体动态地观察差异蛋白质分子在DAI组和对照组大鼠脑组织中的分布特征。基于MALDI-TOF IMS建立大鼠DAI诊断模型,从而能实现对弥漫性轴索损伤进行诊断的目的。