第一部分47例血友病乙患者的基因分析及发病机制研究研究目的血友病乙（Hemophilia B,HB）为X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，其发病机制多为F9基因突变致凝血因子IX缺乏或结构功能的异常，导致血友病乙的发生。凝血因子IX（Factor IX）在内源性凝血途径中发挥着重要作用，活化的凝血因子IX在凝血因子VIII、钙离子及磷脂的共同作用下可将Factor X激活，启动共同凝血途径，发挥止凝血作用。血友病乙患者的主要临床表现是自幼反复发生的异常出血，大多数患者因皮肤或关节的反复出血而就诊。目前国内外所报道的血友病乙患者均能找到相应的分子缺陷，以错义突变为主，其中点突变占60～80%左右。为了确诊血友病乙患者的分子缺陷及寻找F9基因突变的规律，为遗传学咨询奠定基础，我们对47例明确诊断的血友病乙的男性患者进行基因测序和分析以求解决此问题。研究方法3年来我们收集血友病乙男性患者47例，均根据临床表现、血浆凝血因子IX活性检测及家族史等资料确诊。常规方法收集患者及亲属血样，分离血细胞和血浆，提取DNA,多聚酶联反应（PCR）扩增结合直接测序法分析先证者的F9基因的所有外显子及其侧翼序列，并将测序结果和国际F9基因突变数据库进行比对，发现突变后排除多态性。结果对47例HB患者进行基因分析共发现40种基因突变，突变类型包括插入框移突变2种，无义突变6种，剪切位点的突变2种，错义突变30种。其中33种突变为已报道的突变类型，7种突变国际上未见报道。40种突变中发生在信号肽序列的有3种，前肽及γ-羧基化结构域的有7种突变，表皮生长因子样结构域有7种，活化肽区域有5种，丝氨酸蛋白酶催化结构域有18种突变。结论通过基因分析，直接阐述了血友病乙患者发病的分子学机制，对进行进一步的功能方面的研究提供了基础。47例HB患者的基因分析表明F9基因突变具有明显的异质性，且错义突变仍是目前F9基因的主要突变方式，与重型HB有更密切的联系。F9基因突变所常见的外显子部位与他们编码的氨基酸蛋白行使功能时所起的作用有关。直接进行基因测序对血友病乙的携带者诊断及产前诊断提供了一种快速、准确的诊断方法。第二部分一例女性血友病乙患者发病机制的研究研究目的血友病乙（Hemophilia B, HB）是凝血因子IX（factor IX, FIX）基因突变引起血浆FIX量的缺乏或质的缺陷所导致的一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，男性通常有临床出血的症状表现，而女性为携带者，无明显的出血症状。女性血友病乙患者罕见，目前国外报道有几例女性患者。本研究对一例女性患者及其家系的其他成员进行了表型及基因分析，了解基因型与表现型的关系，了解FIX蛋白结构与功能的关系，研究基因突变对FIX蛋白表达量及功能的影响，旨在从分子水平阐明该例女性患者的发病机制。方法1.采集该例女性HB患者及家系成员的外周静脉血，检测血浆中部分活化凝血活酶时间(Activated Partial Thrombinoplstin Time, APTT)、血浆凝血酶原时间(Prothrobin Time, PT)、血浆凝血酶时间(Thrombin Time, TT)、血浆纤维蛋白原(Fibrinogen, FIB)、FVIII:C及FIX:C活性。2.提取外周血基因组DNA，应用PCR法扩增患者F9基因的8个外显子及其侧翼序列，产物经测序分析寻找突变位点，并排除突变位点的多态性。3.采用基于PCR的定点突变技术构建携带特定突变位点的突变型质粒。4. Western blotting方法分析患者外周血浆中FIX蛋白的含量。5.以野生型质粒为对照，在HEK293细胞中表达突变型质粒，分别测定转染细胞上清液及裂解液中的FIX蛋白含量。结果1.该例女性患者及其妹妹、母亲、女儿及外甥女的APTT及FIX:C分别有不同程度的延长和降低，其姑姑的APTT及FIX:C均为正常，所有家族成员PT检测及FVIII:C均在正常范围。2.通过基因测序分析，在该例女性患者及妹妹的FIX基因中均发现了30992G>C(Ala291Pro)纯合突变，其母亲、女儿和外甥女均发现了相应的杂和突变，其姑姑的F9基因中未发现基因突变。通过特异性限制性内切酶BsmI排除了基因的多态性。3.与正常人血浆中的FIX蛋白含量相比，患者外周血浆中检到痕量的FIX蛋白。4.体外表达实验显示，与转染野生型F9WT细胞表达上清及中的FIX蛋白比较，F9MT(G30992C)表达上清中未检测到FIX蛋白的表达。与转染野生型F9WT细胞裂解液中的FIX蛋白比较，F9MT(G30992C)无明显变化。结论1. F9基因纯合突变（G30992C）是导致该例女性患者发生的分子病理机制。2. G30992C突变未影响FIX蛋白的表达，但明显影响FIX蛋白的分泌、转运，可能是通过改变FIX蛋白的空间构象，导致其不能有效的分泌至胞外。