[背景]疼痛的机理至今未能解释清楚,但疼痛却常常是病人到医院就诊的主要原因。疼痛通常可分为两类：一类是疾病的信号,即疼痛只是疾病的一种症状,如感冒发烧的头疼脑热等。只需把疾病治愈,作为疾病信号的疼痛就会消失。另一类疼痛本身就是疾病。如三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、癌症疼痛(癌症晚期已经治疗无效,但是还有半年到一年的生存期,但疼痛往往使病人可能只存活两三个月)、患肢痛、顽固性腰腿痛等。总的说来,疼痛到难以控制,威胁到病人生命的时候,疼痛就从疾病的症状转变为疾病,需要针对疼痛进行镇痛治疗。疼痛医学在发达国家已受到极大的关注和重视,2000年,世界卫生组织给“疼痛”正式下了定义：慢性疼痛是一类疾病。并且,把疼痛列为继呼吸、脉搏、体温和血压之后的人类第5大生命指征。而我国目前慢性疼痛的治疗还处于起步阶段。存在治疗疼痛的手段单一,药物治疗为主导,包括各种麻醉、镇痛药物的口服和注射、麻醉药物神经阻滞(Nerven-blockade)疗法等。但存在着口服药物胃肠道反应大,不宜长期应用,麻醉剂成瘾性和神经阻滞专业技术要求高,难以普遍推广应用等问题。如何快速、安全、稳定、有效、可控性镇痛,提高镇痛质量一直是医学界共同关注的重大课题之一。随着传统中药的研究与现代药理研究的不断深入,发现许多中草药具有明显的镇痛效果,对多种疼痛的镇痛疗效确切。而且没有明显的成瘾性、耐受性等毒副作用。是当今镇痛药研究的热点。尤其是近年来我国利用超微粉碎技术制备的比较成熟的微米中药镇痛剂,微米中药是指微米级(平均直径≤15μm)中药有效成分、有效部位、原药及其复方制剂。它是中药微米化后的产物,不是一种新的药种。既能有效保留中药得有效成分不被破坏,同时由于制得的颗粒比表面积增大,能有效增进药物有效成分的溶出,提高药物的生物利用度；其次它可以提高药物的靶向性,有助于控制药物在体内的分布等；其在体内的传输更方便,不仅可以缓释药物,延长药物的作用时间,并能达到靶向输送的目的,从而显著提高了中药的疗效,降低其毒副作用,提高药物稳定性,这与中药现代化的核心”安全、有效、可控、稳定”息息相关。经皮给药是目前国际医药界热门的研究领域,强力渗透(物理经皮定位透药)是发展最快的技术分支。特别是几种物理方法之间及物理方法及其它促渗方法之间作用的叠加与协同深受业内人士的关注。近来研究较多的方法有：激光微孔技术(laser microdissection LMD)、电致孔技术(electropration)、超声透皮技术(sonophoresis)和现代离子导入技术(iontophoresis)等。超声电导靶向给药治疗技术是近年来美国等西方国家兴起的新的药物治疗技术。它通过综合采用激光微孔、电致孔、超声空化和离子导入技术四种应用于现代生物工程的高技术手段,使药物透过皮肤进入体内病变组织和器官,直接发挥药物治疗作用。首先在一定范围和深度内使皮肤和组织对药物的通透性大大增加,形成药物进入靶器管的人工生物通道。然后在特定的动能驱动下,使药物粒子沿生物通道透过皮肤、组织和包膜,定向、定量、定速的进入病变组织和器官,最终在靶组织内形成药物高浓度浸润区,直接发挥药物治疗作用,达到靶向治疗的目的。被医学界称为第三代给药方法。其作用优势：1、透药速度快,比自然渗透高上百倍；2、可实现定时、定量及定速给药,在病变局部形成药物高浓区,并可促进药物向细胞内的转运,增加药物的作用,从而提高疗效；3、大大提高药物的生物利用度,减少用药总量,避免毒副作用；4、药效稳定持久,比口服药长2—3倍；5、适应范围大,除化学药物外,还能透过大分子身生物制剂和中药胶体颗粒成份；6、无痛、无创、简捷、方便。目前美国等发达国家已成功地将这一方法用于抗生素、激素、抗癌药、镇痛药等九大类300余种药剂,特别是一些高活性、高毒性、高风险而又需要局部高高浓度的药物,用此方法发挥了独特的治疗效果。国内亦有应用该疗法治疗局灶性感染性疾病、前列腺疾病、骨关节疼痛等疾病的临床报道。近年来国内外研究较多的是局部镇痛药物(如麻醉、镇痛和非甾体类抗炎等药物)经皮透入治疗各种局灶性疼痛。大量的实验(包括离体实验、动物实验和人体实验)及临床应用取得了可喜的成果。但西药镇痛药的成瘾性、耐受性等毒副作用依然制约着临床的广泛应用。国内北京诺亚同舟医疗技术有限公司应用超声电导仪,参照美国产品技术改造而成既可适用于化学药物和生物药物、又适合中药制剂的耦合凝胶贴片,其产品已应用于临床。但其贴片需另外加入各种药物,每片加入药量仅0.5ml,人为影响因素大,存在药量和局部有效浓度不易控制,可能影响疗效,同时存在使用不方便等不足。本研究运用目前中药现代化最前沿的创新成果-微米中药技术,将经现代药理研究证实的中药镇痛药微米化后,研制出含有微米中药的凝胶药物贮库贴片,该凝胶贴片具备骨架型经皮给药系统的特点,贮库的微米中药在超声电导仪的作用下,直接释放药物到皮肤并扩散到病变组织,并保持稳态的血药浓度,从而达到快速镇痛的目的。国际医药界认定,这一方法将成为新世纪的主导药物治疗方法。活血镇痛散为我院中医科梁教授祖传用于治疗急性软组织损伤的外治经验方,由骨碎补、三七、红花等多味中药组成,具有活血化瘀、消肿止痛、舒筋活络、疗伤接骨等作用,主要用于治疗扭挫伤痛、风湿痹痛、冻疮红肿、软组织损伤及骨折等。本研究产品——微米中药耦合凝胶贴片,先将中药验方”活血镇痛散”微米化,并经药理实验证实其疗效,然后参照美国相关技术研究制作出超声电导微米中药凝胶贴片,该贴片采用改良性纤维网织材料内充水化凝胶基质为微米中药贮库,既有很好的承载能力和控释能力,同时具有超声耦合和导电等作用,能满足超声电导透皮治疗的需要,同时便于给药剂量的标准化、规范化,以及制剂生产工艺、质量控制的标准化和规范化。本研究包括三大项内容,分别为：正交设计进行活血镇痛散的醇提工艺研究、活血镇痛散的质量标准研究、超声电导经皮透入微米活血镇痛散的镇痛机理和应用基础研究。正交设计进行活血镇痛散的醇提工艺研究：采用传统水提法提取的活血镇痛散药效不明显,推测可能为有效成分提取不充分所致。方中君药骨碎补主要活性是以柚皮苷为代表的二氢类黄酮化合物,易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂,臣药三七主要有效成分是三七皂苷和人参皂苷类(Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re)等,易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。本实验以处方的醇浸膏得率和君药骨碎补有效成分柚皮苷含量为考察指标,采用L。(34)正交实验法对活血镇痛散醇提取工艺进行优化筛选。活血镇痛散的质量标准研究：为更好的控制药品的内在质量,确保临床用药的安全有效性,进行了活血镇痛散的质量标准研究。本实验采用薄层色谱法对活血镇痛散中的骨碎补、三七、红花、土鳖虫、半枝莲、冰片进行定性鉴别研究,并对复方中重金属和砷盐的含量限度进行了实验考察,以供制定质量标准参考。超声电导经皮透入微米活血镇痛散的镇痛机理和应用基础研究：是超声电导经皮透药新技术和微米中药新剂型相结合的实验和应用基础研究,旨在观察超声电导经皮透入微米活血镇痛散、超声电导物理治疗及微米活血镇痛散外敷作用于兔软组织损伤模型,以三七粉的微米程度,软组织挫伤处肿胀面积、外周血液白细胞数变化、光镜下组织学观察为考察指标。观察其治疗效果,同时考察超声电导透皮给药方法的作用条件和影响因素,探讨其作用机制并考察用药安全性。[目的]首先优化筛选出活血镇痛散的最佳醇提取工艺,观察醇提浓度、加醇量、提取时间时间、提取次数等因素对活血镇痛散醇提取工艺的影响,其次更好的建立活血镇痛散的质量控制标准,补充中药质量标准参考,最终观察超声电导经皮透入微米活血镇痛散对兔急性软组织损伤模型的影响,为其临床应用和成果转化提供依据,申请专利。[方法]正交设计进行活血镇痛散的醇提工艺1.实验考察因素及水平：对乙醇体积分数(A)、加醇量(B)、提取时间(C)3个因素进行考察。同时每个因素中选出常规的3个水平,即乙醇体积分数：85%、65%、50%；加相应体积分数乙醇量(倍)：7、6、6,6、5、5,5、4、4；提取时间(h)：2.5、2.0、2.0,2.0、1.5、1.5,1.5、1.0、1.0。2.处理方式：采用L9(34)正交实验法对活血镇痛散醇提取工艺进行优化筛选。3.观察指标：醇浸膏得率、吸醇率和HPLC法测定的柚皮苷含量活血镇痛散的质量标准控制研究1.定性鉴别方法：采用薄层色谱(TLC)法对活血镇痛散中骨碎补、三七、红花、半枝莲、土鳖虫、冰片进行定性鉴别；2.重金属和砷盐考察方法：重金属采用纳氏比色法,砷盐采用古蔡氏法测定限量：3.观察指标：定性鉴别中,观察在供试品色谱中,在与对照药材及对照品色谱相应位置上是否显相同的斑点,阴性对照是否无干扰。重金属考察中,以样品纳氏比色管与标准铅纳氏比色管相比较所显颜色的深浅,判定样品中重金属的含量限度。砷盐考察中,将生成的样品砷斑与标准砷斑相比较,判定样品中砷盐的含量限度。超声电导经皮透入微米活血镇痛散的镇痛机理和应用基础研究1.急性软组织损伤模型的建立及实验分组：取新西兰大白兔,选择兔后肢大腿外侧,距窝4～7cm处,用自制打击棒自由落体击打兔大腿外侧部,并证实无骨折后表示模型建立成功。取造模成功兔24只,随机分4组,每组6只。即：模型对照(1组)、超声电导经皮透入空白凝胶贴片(2组)、超声电导经皮透入微米活血镇痛散(3组)及微米活血镇痛散外敷(4组)2.微米活血镇痛散凝胶贴片的制备过程为：①将活血镇痛散所用药物粉碎过筛。②醇提活血镇痛散药方中有效成分,并制得干膏粉。③采用惰性气氛保护的高能球磨装置系统制备微米三七粉。④在干膏粉中加入冰片和微米三七粉末,混合均匀,加入空白凝胶贴片中(内充水化凝胶基质、促渗剂、PVA等)制成复方中药凝胶贴片,使中药药膏成分均匀地混吸改良性纤维网织材料内充水化凝胶基质中,即为微米活血镇痛散的凝胶贴片。3.实验治疗方法：各组动物(除1组外)于造模后2h后开始用药治疗,具体如下：第2、3组将凝胶贴片贴与治疗头,将治疗头固定在损伤的软组织处。并用约束带固定治疗部位,治疗强度及参数选择：致孔2、超声2、中频1、时间15min,治疗结束后去除治疗头保留贴片2h,2次/日,连续4d。第4组按给药剂量外敷于患处2次/日,并固定保留药物2h,连续4d。4.皮肤用药急性毒性试验及皮肤刺激性试验方法：皮肤用药急性毒性试验：取兔15只随机分五组,即：一组对照组3只(涂生理盐水1mL),四组试验组12只(完整皮肤组及破损皮肤组,各2个剂量)。低剂量组以临床用制剂量,高剂量组为低剂量组2-3倍。分别将药物均匀地混吸于改良性纤维网织材料内充水化凝胶基质的空白凝胶贴片中。皮肤刺激性试验：取兔6只随机均分为完整皮肤组3只及破损皮肤组3只。分别在脱毛后第2天,把微米凝胶贴片贴于脱毛区一侧,并用无刺激性纱布加以固定。每只动物单笼饲养。涂药24h后,揭开纱布并用温水洗涤去除残留受试药物。5.指标检测方式：三七粉微米化前后在扫描电镜下行粒径对比；测量并计算四组每日肿胀面积变化情况,连续测4d；抽血测量造模前,造模后第2、3、4日兔耳缘静脉白细胞数值变化；4d后取动物同一打击部位、大小相等的组织块石蜡包埋切片,HE染色,光镜下病理组织学观察并评分；观察去除受试物1,24,48,72h至第7d,每日观察并记录动物体重、皮肤毛发、眼和粘膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等其他中毒表现。肉眼观察记录去除受试物1,24,48,72h涂抹部位局部有无红斑和水肿等反应。并按皮肤皮肤刺激性反应评分标准评分,记录各时日的评分值。[统计学方法]实验数据计量资料均以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS13.0软件进行统计分析。两个独立样本的总体均数比较采用独立样本t检验,L9(34)正交实验设计采用正交设计资料的方差分析,多组间计量资料比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA),不同时间点的软组织挫伤处肿胀面积变化及外周血液白细胞数比较采用重复测量的方差分析。检验标准α定为0.05。[结果]正交设计进行活血镇痛散的醇提工艺1.方法学考察结果标准曲线方程为：Y=72.008X+18.041,r=0.9994(n=6)。结果表明,柚皮苷在0.135-1.620 mg/L范围内具有良好的线性关系；精密度试验测得RSD值为0.86%；重现性试验测得RSD值为1.46%；稳定性试验测得RSD值为1.04%,表明供试品溶液在24h内基本稳定；加样回收率试验结果：回收率102.46%,RSD值为2.31。2.吸醇率考察结果：吸醇率平均值为265.67mL/g, RSD为1.48%表明提取时第1次醇提取时应加相应体积分数乙醇量3倍量以上。3.渗漉法与回流提取法比较结果：回流提取的柚皮苷提取量平均值为238.23±7.00mg/g,RSD为5.86%；渗漉的柚皮苷提取量平均值为238.18±5.86mg/g, RSD为7.00%。两组均数经两独立样本t检验差异具有统计学意义(t=-8.039,P=0.000),可认为渗漉法与回流提取法柚皮苷提取量差异具有显著性意义,参考两法均值,结果表明醇提以回流法为好。4.醇提次数的选择试验结果：第3次醇提的醇浸膏得率及柚皮苷提取量所占比率均大于10%,应进行3次醇提方可完全提取药物成分。5.正交设计实验结果：乙醇体积分数(因素A)各水平均值分别为A1=87.197,A2=91.789,A3=81.367；加醇量(因素B)各水平均值分别为B1=90.607,B2=91.828,B3=77.917；提取时间(因素C)各水平均值分别为C1=86.282,C2=87.241,C3=86.829。方差分析结果乙醇体积分数、加醇量两因素影响具有显著性意义(FA=19.738、PA=0.048,FB=19.738、PB=0.023),提取时间因素影响不具有显著意义(Fc=0.167、Pc=0.857)。结合各因素各水平均值认为A2B2C2为好；选择A2B2C2组合为优选工艺,即药材加乙醇回流提取3次,第1次加6倍量体积分数65%乙醇提取2h,第2次加5倍量体积分数65%醇提取1.5h,第3次加5倍量体积分数65%醇提取1.5h。活血镇痛散的质量标准控制研究1.采用薄层色谱(TLC)法对复方药材定性鉴别结果：①骨碎补：供试品色谱中,在与对照药材及对照品色谱相应位置上显相同的黄色荧光斑点,阴性对照无干扰；②三七：供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,分别显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰；③红花：供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,日光下显相同颜色的浅红色斑点；④半枝莲：供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰；⑤土鳖虫：供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的暗红斑点；⑥冰片：供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的红色斑点,阴性对照无干扰。2.重金属考察结果：供试样品纳氏比色管所显颜色较标准铅纳氏比色管颜色浅,判定样品中重金属的含量<10ppm。3.砷盐考察结果：生成的供试样品砷斑与标准砷斑颜色相比较,颜色明显较浅。判定样品中砷盐的含量限度<1ppm。超声电导经皮透入微米活血镇痛散的镇痛机理和应用基础研究1.微米三七粉的电镜扫描结果：根据高能球磨制备微米三七粉的方法,每半小时取粉观察颜色和气味,发现在球磨前粉体保持新鲜颜色,三七粉气味浓厚。球磨8h后粉末逐渐变黑,气味变淡,可能是球磨时间过长,导致三七粉碳化所致。故取8h为最佳球磨时间。球磨8h后三七粉由大颗粒形貌转化成层片状,片层厚度不大于1.5μm,大颗粒粒径在13μm左右,达到微米要求。2.对兔急性软组织损伤肿胀的影响结果：造模后伤处软组织即出现肿胀、皮肤瘀斑及皮下出血,伤后24小时最明显,随后肿胀逐渐减轻,四组间肿胀面积变化值差异有统计学意义(F=48.250,P=0.000)。超声电导经皮透入微米活血镇痛散组、敷帖微米活血镇痛散组及超声电导物理治疗组于第2、3、4d肿胀面积减轻程度均优于急性软组织损伤组,差异均有统计学意义(P<0.01),且超声电导经皮透入微米活血镇痛散改善并减轻肿胀程度最明显。3.对兔急性软组织后外周血白细胞数变化的影响结果：中性粒细胞数量增加提示炎性反应存在,与造模前模型组比较,造模后四组外周血液白细胞数目均明显升高(F=505.605,P=0.000),表明急性软组织损伤造成炎性反应。四组间差异有统计学意义(F=172.452,P=0.000)。与急性软组织损伤组比较,超声电导经皮透入微米活血镇痛散、敷帖微米活血镇痛散均能明显减少损伤局部白细胞数(P<0.01),且超声电导经皮透入微米活血镇痛散改善最明显。4.兔组织病理评分及病理切片镜检结果：治疗4d后根据病理组织学观察评分,统计方差分析结果示：整体而言组间均数有显著差异(F=14.182,P=0.000),与急性软组织损伤组比较,超声电导经皮透入微米活血镇痛散、敷帖微米活血镇痛散均能明显减轻炎症反应(P<0.01),促进损伤局部胶原纤维合成,肌纤维组织修复。且超声电导经皮透入微米活血镇痛散改善最明显。第四日4组镜下组织学改变图示：①第1组：各兔打击肌肉处可见大量肌细胞断裂.广泛出血。局部可见大片炎性渗出及坏死,界限不清,外周见丰富的肉芽组织,主要由炎症细胞、纤维母细胞及毛细血管构成,断裂的肌细胞周围见增生的多核的肌母细胞,并伴有大量急、慢性炎细胞浸润。②第2组：炎性渗出及坏死已完全消失,肉芽组织也减少,代之以大片的胶原纤维,断裂处基本修复,修复处肌细胞排列稍紊乱。③第3组：见打击处肌肉已基本修复,肌细胞排列较整齐,局部见束状的胶原纤维,肌细胞间见少量炎细胞浸润。④第4组：未见渗出及坏死,肉芽组织面积较模型组明显减小,肌细胞增生。⑤第5组(正常兔肌肉组织)：各兔肌肉组织形态较一致,肌细胞呈束状平行紧密排列,细胞呈长梭形,胞浆丰富,核呈短棒状。5.微米中药凝胶贴片的皮肤急性毒性实验结果：：从去除受试物1h开始观察,直至第7d,实验动物活动自如,觅食正常,涂药处皮肤毛发光泽正常,眼与黏膜无变化,呼吸无异常,未见中枢神经系统异常表现,未见兔全身中毒反应,未发生动物死亡,表明微米活血镇痛散低、高剂量外用时未出现任何急性毒性反应。6.微米中药凝胶贴片的皮肤刺激性实验结果：活血镇痛散纳米凝胶贴一次给药,新西兰大白兔完整皮肤组及破损皮肤组均未见红斑、水肿,亦无其它异常情况,刺激指数均小于0.4。说明微米中药凝胶贴片一次给药对兔完整皮肤及破损皮肤均无明显刺激性。破损皮肤虽有小块血痂形成,4天内先后脱落,贴药区与对照区无明显差异,乃是划伤所致,并非药物引起。[结论]活血镇痛散的最佳提取工艺是：药材加乙醇回流提取3次,第1次加6倍量体积分数65%乙醇提取2h,第2次加5倍量体积分数65%醇提取1.5h,第3次加5倍量体积分数65%醇提取1.5h。TLC可检出骨碎补、三七、红花、半枝莲、土鳖虫及冰片特征性的斑点。复方中药的砷盐含量限度≤1ppm、重金属含量限度≤10ppm,达到了重金属及砷盐限量标准。超声电导经皮透入微米活血镇痛散治疗兔急性软组织损伤具有较好的消肿抗炎,减轻炎症反应,促进炎性渗出物吸收及损伤处软组织修复作用。作用明显优于超声电导物理治疗及微米活血镇痛散外敷,且对皮肤安全无刺激,属安全新型中药凝胶贴片。