一、研究背景和目的在资源昆虫中,家蝇(Musca domestica)的研究和开发利用一直受到国内外研究者的重视。家蝇幼虫(蛆)除含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、矿物质等营养物质外,还含有甲壳素、抗菌肽、凝集素、溶菌酶等生物活性物质,在生物医药、食品和饲料开发等方面有着广泛的应用价值。在畜禽和水产动物养殖研究中,因家蝇幼虫的蛋白质含量较高,一般认为它是鱼粉的优质替代物,可作为饲料蛋白质源组分。也有研究认为,蝇蛆所含有的优质脂肪、矿物质等营养物质和抗菌肽、凝集素等生物活性物质具有促进动物生长,增强动物免疫力的作用。相对于其它几种活性成分,甲壳素在家蝇幼虫蛆壳中的含量较高,可达20%-30%。蝇蛆中的甲壳素以蛋白聚糖的形式存在,并伴生着碳酸钙,直接添加于饲料中难以被消化,没有营养作用,有研究认为蝇蛆中的甲壳素可机械性地阻碍肠道吸收蛋白质等营养物质,是一种抗营养因子,影响动物的消化和吸收功能。作为一种新型的饲料酶制剂,甲壳素酶可降解甲壳素为水溶性寡糖,消除其抗营养因子作用,甲壳素寡糖的生物活性与甲壳素类似或更高,既可作为一种免疫增强剂也可作为一种营养性多糖利用。因此,可以把甲壳素酶作为一种消除抗营养因子的饲料酶制剂添加于含蝇蛆组分的饲料中,降解其中的不溶性甲壳素以提高动物对其它营养物质的吸收和利用。目前,通过基因重组技术将特定酶基因转移到适宜宿主菌内发酵已成为生产饲料酶的有效途径。作为一种新的蛋白质表达技术,酵母表面展示系统可以把各种生物活性酶表达并固定于细胞表面,产生具有活性的酵母全细胞酶,而利用全细胞酶作为饲料添加剂可避免胞外表达饲料酶制剂生产过程中的纯化和载体吸附等繁琐的下游程序。因此,为了消除家蝇幼虫中甲壳素的抗营养因子作用,充分发挥其生物活性,本课题利用公认安全的酿酒酵母作为表达宿主,在其表面展示一种耐热甲壳素酶,制备出具甲壳素降解活性的全细胞酶,通过鲫鱼养殖试验评价其作为饲料酶添加剂降解蝇蛆中甲壳素后对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响,以期研制出一种具有消除甲壳素抗营养因子作用并可促进动物生长、增强动物免疫力的饲料酶制剂,同时进一步提高家蝇蛆粉作为饲料添加剂的利用价值。论文包括五个部分：(1)序言(研究背景、目的和思路)(2)蝇蛆常规营养成分分析及所含甲壳素的提取与制备(3)蝇蛆粉对鲫鱼的生长性能和非特异性免疫能力的影响(4)利用酵母表面展示技术研制一种具甲壳素降解活性的热稳定的全细胞酶(5)酵母酶作用于家蝇蛆粉后对鲫鱼的生长性能和非特异性免疫能力的影响二、研究方法在对家蝇蛆粉的主要营养成分(水分、蛋白质和脂肪)含量进行测定的基础上,用蝇蛆粉按不同比例取代鱼粉对鲫鱼进行12周饲养试验,观察蝇蛆粉对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响。在综合分析上述实验结果的基础上,针对蝇蛆粉中具有的甲壳素可能作为一种影响动物摄食和消化的抗营养因子的情况,研制一种表面展示甲壳素酶的全细胞酵母酶作为降解抗营养因子的饲料酶制剂,并按不同比例添加于含有蝇蛆粉的饲料中,对鲫鱼进行12周饲养试验,观察添加酵母酶作用于蝇蛆粉中的甲壳素后对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响。具体研究方法如下：1.采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分别测定鱼粉和蝇蛆粉的水分、蛋白质和脂肪含量；采用酸碱法和微波加热法提取蝇蛆壳中的甲壳素。2.按照试验要求选择96尾鱼苗,随机分为4组,每组24尾,每组3个重复,每个重复8尾,其中,第1组为对照组,投喂基础饲料；其它3组为试验组,分别投喂含蝇蛆粉为5%、10%和15%的试验饲料,进行12周养殖试验,观察蝇蛆粉对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响：(1)通过鱼体的初始、终末体重和饲料消耗量计算各生长指标(体重增加、相对增重率、特异生长率和饲料系数),统计成活率。(2)采用稀释法计数鲫鱼单位容积内的红细胞和白细胞数,采用Wright-Giemsa复合染色法进行白细胞分类计数。(3)应用硝基四氮唑蓝还原法检测血液中嗜中性粒细胞的杀菌功能；以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑蓝还原法检测白细胞的呼吸爆发活性。(4)分别采用比浊法、黄嘌呤氧化酶法和铁还原能力测定法测定血清和肝胰脏中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力。(5)分别采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法检测肠和肝胰脏中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。(6)测定鲫鱼的含肉率；采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分别测定鲫鱼肌肉的水分、蛋白质和脂肪含量。3.利用酵母表面展示技术研制一种热稳定的具甲壳素降解活性的全细胞酶(1)根据GenBank公布的粘质沙雷氏菌甲壳素酶C基因(Serratia marcescensChiC)编码序列设计引物,从粘质沙雷氏菌基因组DNA中克隆出ChiC基因,经测序鉴定和生物信息学分析后构建表面展示载体pYD1-SMChiC,利用a-凝集素受体系统把SMChiC锚定于酵母细胞的细胞壁,构建具有甲壳素降解功能的酵母细胞,并采用Western blot对纯化的表达产物进行鉴定,采用细胞免疫荧光染色检测目的蛋白在细胞表面的锚定情况。(2)优化酿酒酵母表面展示SMChiC的表达条件,采用SDS-PAGE酶谱法鉴定纯化酶的甲壳素降解活性,采用琼脂平板培养法和二硝基水杨酸比色法对酵母细胞的甲壳素降解活性进行定性和定量测定。(3)测试温度和pH对酵母细胞或纯化产物的甲壳素降解活性的影响。4.按照试验要求选择96尾鱼苗,随机分为4组,每组24尾,每组3个重复,每个重复8尾,其中,第1组为对照组,投喂基础饲料；其他3组为试验组,分别投喂含酵母酶为0.5%、1.0%和1.5%的试验饲料,进行12周养殖试验,观察酵母酶作用于蝇蛆粉中的甲壳素后对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响：(1)通过鱼体的初始、终末体重和饲料消耗量计算各生长指标(体重增加、相对增重率、特异生长率和饲料系数),统计成活率。(2)采用稀释法计数鲫鱼单位容积内的红细胞和白细胞数,采用Wright-Giemsa复合染色法进行白细胞分类计数。(3)应用硝基四氮唑蓝还原法检测血液中嗜中性粒细胞的杀菌功能；以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑蓝还原法检测白细胞的呼吸爆发活性。(4)分别采用比浊法、黄嘌呤氧化酶法和铁还原能力测定法测定血清和肝胰脏中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力。(5)分别采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法检测肠和肝胰脏中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。(6)测定鲫鱼的含肉率；采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分别测定鲫鱼肌肉的水分、粗蛋白质和粗脂肪含量。(7)采集鲫鱼肝胰脏、脾脏、肾脏、肠样本制片并进行苏木素-伊红染色,观察酵母酶对鲫鱼组织结构的影响。4.实验数据均以均数与标准差(x±sd)表示,应用SPSS13.0统计软件分析处理实验数据。其中,蝇蛆粉和鱼粉的蛋白质含量采用独立样本T检验,P<0.05为差异有统计学意义(n=3)。鲫鱼的生长指标、各类血细胞比例或含量、NBT还原能力和呼吸爆发活性、相关酶的活性和总抗氧化能力、肌肉含肉率及主要营养物质含量等指标(n=3)的组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),满足方差齐性和方差分析显著的情况下,采用Bonferroni法进行组间差异的多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。三、研究结果1.对家蝇蛆粉和鱼粉的常规营养成分测定结果：蛋白质含量分别为61.51±1.08%和60.32±1.10%,蝇蛆粉和鱼粉之间的差异无统计学意义(t=1.337,P=0.252)。水分分别为6.95±0.11%和8.74±0.13%；脂肪含量分别为13.71±0.13%和7.32±0.11%。以蝇蛆壳提取的甲壳素占干壳重的27.62±0.26%。2用蝇蛆粉按不同比例取代鱼粉对鲫鱼进行12周喂养试验,结果显示：(1)鲫鱼的体重增加(F=7.735,P=0.009)、相对增重率(F=7.143,P=0.012)、特定生长率(F=7.141,P=0.012)和饲料系数(F=7.208,P=0.012)在四组间的差异均具有统计学意义,10%蝇蛆粉组的上述各指标效果与对照组之间的差异具有统计学意义(对应的P值分别为0.009、0.012、0.012和0.012)；5%蝇蛆粉组(对应的P值分别为0.261、0.349、0.353和0.184)和15%蝇蛆粉组(对应的P值分别为0.069、0.099、0.094和0.063)和对照组之间的差异无统计学意义。(2)鲫鱼的白细胞呼吸爆发活性(F=53.138,P<0.001)、嗜中性粒细胞的吞噬功能(F=17.817,P=0.001)、血清SOD酶活性(F=10.593,P=0.004)、肝胰脏SOD酶活性(F=4.972,P=0.031)、血清总抗氧化能力(F=9.042,P=0.006)、肝胰脏总抗氧化能力(F=9.343,P=0.005)在四组间的差异均具有统计学意义。其中,以10%蝇蛆粉组的上述各种指标均显著高于对照组(P值分别为0.001、0.001、0.004、0.046、0.015和0.006)；鲫鱼血清中溶菌酶活性有增强的趋势,但差异无统计学意义(F=0.118,P=0.947)。(3)中性粒细胞分数(F=0.612,P=0.626)、嗜碱性粒细胞分数(F=0.225,P=0.876)、淋巴细胞分数(F=0.387,P=0.766)、单核细胞分数(F=0.409,P=0.751)、红细胞含量(F=0.354,P=0.788)和白细胞含量(F=0.248,P=0.861)在四组间的差异无统计学意义。(4)肠组织淀粉酶活性(F=0.273,P=0.844)、肝胰脏淀粉酶活性(F=1.698,P=0.244)、肠组织胰蛋白酶活性(F=1.815,P=0.222)和肝胰脏胰蛋白酶活性(F=3.301,P=0.079)在四组间的差异无统计学意义。(5)鲫鱼含肉率(F=3.272,P=0.080)、肌肉的水分(F=0.284,P=0.836)、蛋白质含量(干重%)(F=1.714,P=0.241)和脂肪含量(干重%)(F=0.026,P=0.994)在四组间的差异无统计学意义。3.从Serratia marcescens AS1.1652菌株基因组中扩增得到了ChiC基因编码序列,测序结果分析表明,AS1.1652ChiC基因含有1443bp,推导的Serratia marcescens AS1.1652chitinase C含有480个氨基酸,预测该蛋白的等电点为5.36,分子量约为52kD,且该蛋白不含信号肽。Serratia marcescens AS1.1652chitinase C和其他菌株(stain2170, strain141, strain xd1, stain BJL200)在DNA水平上的相似性分别为96%、96%、96%、98%；在蛋白质水平上的相似性分别为99%、98%、98%、99%。构建的酵母表面展示质粒pYD1-SMChiC中,ChiC基因通过(Gly4-Ser)3Linker编码序列融合于Aga2gene的C端,C端V5表位或6xHis标签可用于融合蛋白质的检测。4.经免疫荧光染色鉴定,证实甲壳素酶已经表达并固定于酿酒酵母细胞表面。表达产物(Aga2-SMChiC融合蛋白)经Western Blot鉴定,大小约67kD；应用琼脂平板法和SDS-PAGE酶谱法检测证实甲壳素酶在酵母中成功表达,且对α-型和p-型甲壳素均具降解活性。对甲壳素酶的表达和展示条件进行了优化,其最佳诱导时间、温度和pH分别为72h、22℃和6.0。5.酵母酶在20℃-80℃之间均具有甲壳素降解活性,在80℃仍然能够检测到初始活性的9%,其最适反应温度为52℃。热稳定性测试表明,70℃处理4h后酵母酶保留其初始活性的88.6%,把酶煮沸1h后其活性仍然保留一定活性,纯化酶的酶谱检测结果也证实在一定高温下酶具有热稳定性。酵母酶在pH2.2-8.0条件下均可显示活性,最适pH为5.0,在酸性条件下,全细胞酵母酶保持一定的稳定性。6.以不同比例的酵母酶添加于含10%蝇蛆粉的饲料中,对鲫鱼进行12周喂养试验,结果显示：(1)鲫鱼的体重增加(F=37.289,P<0.001)、相对增重率(F=33.053,P<0.001)、特定生长率(F=31.435,P<0.001)和饲料系数(F=47.163,P<0.001)在四组间的差异均具有统计学意义。0.5%酵母酶组(P值分别为0.004、0.006、0.008、0.001)、1.0%酵母酶组(P值分别为0.001、<0.001、<0.001、<0.001)、1.5%酵母酶组(P值分别为0.001、0.003、0.003、<0.001)的体重增加、相对增重率和特定生长率均显著高于对照组,而饲料系数均显著低于对照组。(2)鲫鱼的嗜中性粒细胞吞噬功能(F=36.935,P<0.001)和白细胞呼吸爆发活性(F=96.737,P<0.001)在四组间的差异均具有统计学意义。0.5%酵母酶组(P值分别为0.014、<0.001)、1.0%酵母酶组(P值分别为<0.001、<0.001)、1.5%酵母酶组(P值分别为0.037、<0.001)的上述指标均显著高于对照组。(3)鲫鱼血清中的溶菌酶活力(F=34.057,P<0.001)、SOD酶活力(F=33.490,P<0.001)、总抗氧化能力(F=20.579,P<0.001)和肝胰脏中的溶菌酶活力(F=35.497,P<0.001)、SOD酶活力(F=16.673,P=0.001)、总抗氧化能力(F=24.374,P<0.001)在四组间的差异均具有统计学意义。其中,0.5%酵母酶组(P值分别为0.001、0.001、0.002、<0.001)、1.0%酵母酶组(P值分别为0.001、P<0.001、0.001、<0.001)、1.5%酵母酶组(P值分别为0.001、0.001、0.001、<0.001)的血清溶菌酶活性、SOD酶活性、总抗氧化能力和肝胰脏溶菌酶活性均显著高于对照组。1.0%酵母酶组的肝胰脏SOD酶活性显著高于对照组(P=0.001)。1.0%酵母酶组(P<0.001)和1.5%酵母酶组(P=0.004)肝胰脏匀浆中的总抗氧化能力显著高于对照组。(4)中性粒细胞分数(F=1.590,P=0.266)、嗜碱性粒细胞分数(F=0.277,P=0.875)、淋巴细胞分数(F=0.877,P=0.492)、单核细胞分数(F=1.923,P=0.204)、红细胞含量(F=0.344,P=0.795)和白细胞含量(F=0.061,P=0.979)在四组间的差异无统计学意义。(5)肠组织淀粉酶活性(F=0.240,P=0.866)、肝胰脏淀粉酶活性(F=1.285,P=0.344)、肠组织胰蛋白酶活性(F=1.110,P=0.400)和肝胰脏胰蛋白酶活性(F=2.043,P=0.187)在四组间的差异无统计学意义。(6)鲫鱼含肉率(F=0.478,P=0.706)、肌肉的水分(F=1.706,P=0.243)、蛋白质含量(干重%)(F=0.016,P=0.997)和脂肪含量(干重%)(F=0.076,P=0.971)在四组间的差异无统计学意义。(7)病理切片镜检结果表明各酵母酶组饲养鲫鱼主要脏器器官未见异常改变,实验过程中未对鲫鱼脏器造成不良影响。四、结论蝇蛆粉和鱼粉的蛋白质含量相近,但蝇蛆壳中含有的甲壳素不溶于水,可能具有抗营养因子作用。蝇蛆粉部分取代鱼粉能促进鲫鱼生长,提高饲料利用效率,增强鲫鱼白细胞吞噬功能和呼吸爆发能力,并可增强鱼体抗氧化能力,从而增强其非特异性免疫功能,且对鱼肉品质无不良影响。结果表明蝇蛆粉可以部分取代鱼粉作为优质的饲料蛋白质源。表面展示Serratia marcescens ChiC的酿酒酵母全细胞具有甲壳素降解活性,是一种具有热稳定性的耐高温酶,且在较低pH条件仍保持一定的稳定性。具有甲壳素降解活性的酵母酶可消除甲壳素的抗营养因子作用,促进鲫鱼生长,提高饲料利用效率,提高白细胞吞噬功能和呼吸爆发能力,提高鱼体溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力和总抗氧化能力,增强鱼体非特异性免疫功能。添加酵母酶对鲫鱼血液内环境、主要脏器组织结构均无不良影响,不影响鱼肉品质。表面展示Serratia marcescens ChiC的酿酒酵母可作为一种降解抗营养因子的全细胞饲料酶制剂添加于饲料中。