研究背景胃肠道恶性肿瘤是国内常见的恶性肿瘤,且确诊时多数处于进展期,目前的治疗是以手术为主的综合性治疗,但是经过根治术后,仍有约半数的患者5年内出现复发和/或转移,直接影响到患者的长期生存率。腹腔内游离癌细胞(free cancer cell, FCC)和微小癌灶的存在是造成复发转移的主要原因之一。近年来,腹腔镜手术由于其切口小、暴露小、恢复快等微创优势而逐渐应用于胃肠外科,腹腔镜手术一般需要建立人工气腹以显露视野,但是术中气腹介质的影响可能使腹腔游离癌细胞播散种植,气腹的涡流作用,可能使雾化状态的癌细胞弥漫到整个腹腔,粘附于脏器表面而造成广泛的种植和/或转移。对于如何防治胃肠癌术后腹腔复发转移,国内外学者进行了大量的研究,如术前动脉灌注化疗、术中肠腔内化疗、术前放化疗相结合、围手术期的辅助化疗等。近年来腹腔化疗(intraperitoneal chemotherapy, IPC)因其独特的药代动力学特征及其他基础特点而备受重视,腹腔化疗能有效预防及治疗胃肠恶性肿瘤术后腹腔种植和/或转移。研究表明抗肿瘤作用的强弱与肿瘤瘤灶周围的抗肿瘤药物的浓度成正比,腹腔内给药后其代谢途径主要是经门静脉循环系统进入肝脏,由肝脏代谢降解,只有很少一部分通过腹膜廓清直接进入体循环,与静脉化疗全身廓清相比,由于“腹腔-血浆屏障”作用,腹腔内化疗药物浓度可以为血管内给药浓度的数倍乃至数十倍,在腹腔内提供了恒定持久高浓度的化疗药,使腹腔内游离癌细胞和微小癌灶直接浸泡在高浓度的化疗药液中,从而大大加强了抗肿瘤药物的作用。因此,我们设想采用一种新的治疗方法,在保留腹腔化疗药代动力学特点的基础上,结合腹腔镜手术气腹这一特点,在腹腔镜手术气腹过程中同时进行化疗药物雾化治疗,以期安全、有效地杀灭术中游离癌细胞。为探讨其可行性、有效性及安全性,本实验运用自行研发的气雾化疗仪进行体内外实验。目的1、研发气雾化疗仪,该仪器可在不改变化疗药物化学性质的前提下,将液态药物雾化成气雾状态,并能产生一定的压力,可对相对密闭空间进行灌注；2、体外模拟腹腔气雾化疗环境,评价5-Fu气雾对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡率及细胞周期的影响；3、评价5-Fu腹腔气雾化疗对裸大鼠胃癌腹腔种植的疗效及安全性。方法1、气雾化疗仪的研发根据化疗药物(5-氟尿嘧啶)的分子量,选用特定的超声波频率,在不改变化疗药物化学性质的前提下,将其雾化成气雾状态,并控制单位时间内产生气雾状态药物的量；2、体外模拟腹腔气雾化疗环境制作气雾压力瓶：选用容量为1L的负压吸引瓶,其盖上有两小孔,用其中一个作为进气孔,连接气雾化疗仪,另外一个作为测压孔,连接气腹机,检测瓶内压力,另再自行设一小孔作为出气孔,通过气雾化疗仪和出气孔来调节负压瓶内的压力；3、低分化人胃腺癌细胞MKN-45的培养培养于RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清和终浓度均为100单位/ml的青霉素、链霉素)中,置于37℃、5%CO2恒温密闭培养箱中,2--3天传代；4、实验动物健康雄性裸大鼠,10周龄,体重200-230g,共20只,由上海市公共卫生临床中心提供；所有裸大鼠饲养于南方医科大学南方医院实验动物中心,裸大鼠及实验条件达到无特殊病原菌(specific-pathogen-free, SPF)级标准。5、噻唑蓝(MTT)法检测5-Fu气雾对胃癌细胞的增值抑制取对数生长期单细胞悬液以每孔4×103个/ml接种于96孔培养板,37℃、5%C02培养箱中培养；待细胞进入对数生长期后,吸去旧培养液,设计分组,共3组,每组一块96孔板：阴性对照组、5-Fu雾化组及生理盐水组；5-Fu雾化组：置于气雾压力瓶中(预先置于生物安全柜中紫外线消毒60min),盖上盖子,连接气雾化疗仪和气腹机,开放出气孔,将0.1mmol/L5-Fu溶液雾化后通过进气孔进入压力瓶内,调整气雾压力为8mmHg,作用时间为30min；生理盐水雾化组用生理盐水进行雾化,压力和时间同5-Fu雾化组；雾化后加入培养基,然后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h,弃培养液,每孔加入5mg/ml的MTT,继续培养4h后吸出培养液和MTT溶液,每孔加入DMSO 150μl,微孔板振荡器振荡10min后用酶联免疫检测仪测定490nm的吸光度(OD)值,并计算杀伤率。杀伤率(%)=(1-处理组OD值/对照组OD值)×100%。整个实验重复3次；6、流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期单细胞悬液以每孔5×104个/ml接种于6孔培养板,用无血清RPMI-1640培养基同步化,设计分为2组,每组一块6孔板：5-Fu雾化组及生理盐水组,处理同上,作用完之后加入培养基继续培养24小时,收集细胞,用PBS洗涤,加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞,然后加入5μLAnnexinⅤ-FITC混匀,再加入5μLPropidiumIodide,混匀,室温、避光反应15min,使用流式细胞仪检测凋亡细胞所占比例；7、流式细胞仪检测细胞周期变化取对数生长期单细胞悬液以每孔5×104个/ml接种于6孔培养板,用无血清RPMI-1640培养基同步化,分组及处理同上,作用完之后加入培养基继续培养24小时,收集细胞,用PBS洗涤并计数,调整为1×106个/ml的单细胞悬液,用70%乙醇固定,4℃保存,染色前用PBS洗去固定液,加100μL RNase A 37℃水浴30min,再加入400μL PI染色混匀,4℃避光30min,流式细胞仪检测,根据相对不同DNA含量的细胞分布图,拟合出各周期细胞的百分率；8、建立人胃癌细胞MKN-45裸大鼠腹腔游离癌细胞种植模型并随机分组裸大鼠禁食12h,配制胃癌细胞MKN-45单细胞悬液2ml(含细胞5×107个/ml),对其进行腹腔注射,注射后随机分成两组,每组10只,2小时后进行腹腔气雾化疗；9、裸大鼠腹腔气雾化疗裸大鼠通过乙醚吸入性麻醉,成功后将其固定于手术操作台上,并用内置有乙醚棉球的50ml注射器追加麻醉；于裸大鼠左下腹插入两根气腹针,其中一根连接气雾化疗仪,另外一根连接气腹机监测气腹压力,右下腹插入一根输液管,用来调整出口气体流速,维持气腹压约8mmHg左右；实验组：将5-Fu(600mg/m2)用生理盐水稀释成20ml,雾化后注入腹腔；对照组：将生理盐水20ml雾化后注入腹腔；两组作用时间均为30分钟；10、指标观察与测定①一般情况：包括裸大鼠的精神、活动、食欲等,每周称量体重；②血液学生理生化检查：所有裸大鼠在腹腔注射胃癌细胞前1天和腹腔气雾化疗后一周取静脉血2ml进行血液生理生化检查,包括红细胞(RBC)、血红蛋白(HB)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)；③解剖情况：所有裸大鼠于实验后第5周处死,解剖裸大鼠,观察有无腹水,将肉眼观察到可以及明确出现转移的肝脏、脾脏、腹膜、浆膜等组织采集,4%甲醛固定,常规脱水、浸蜡、包埋、切片,行HE染色；④致瘤率；11、统计使用SPSS13.0统计软件进行统计分析,计量资料结果用x±s表示,两组均数比较采用两独立样本t检验,两组生理生化指标变化用协方差分析,致瘤率用x2检验,体重变化采用重复测量方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、5-Fu气雾对胃癌细胞增殖的抑制作用5-Fu气雾化疗组杀伤率为31.13%,生理盐水组杀伤率为4.65%,两组比较差异有统计学意义,(P<0.001)；2、5-Fu气雾诱导细胞凋亡发生的比例5-Fu气雾化疗组细胞凋亡率为12.00%,显著高于生理盐水组2.65%,两组比较有统计学差异(P<0.001)；3、5-Fu气雾对胃癌细胞MKN-45细胞周期的影响与生理盐水雾化组相比,5-Fu雾化组G1期细胞增多[(51.83±1.95)%比(36.41±2.33)%,P<0.001]、S期细胞减少[(16.72±2.36)%比(45.20±3.27)%,P<0.001]、G2期细胞增多[(31.45±1.69)%比(18.39±2.10)%,P<0.001],差异均有统计学意义；4、裸大鼠一般情况实验过程中无裸大鼠死亡,进行腹腔气雾化疗后初期,两组裸大鼠均出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝、活动减少等现象,未出现呕吐和腹泻,数小时后上述症状逐渐减轻、恢复正常；5、致瘤率实验组裸大鼠致瘤率为40%,对照组裸大鼠致瘤率为100%,两组相比,X2=8.57,P=0.003,差异有统计学意义；6、体重变化实验组和对照组裸大鼠体重增长存在显著差异(P<0.001),腹腔气雾化疗前,实验组裸大鼠体重为219.67g,对照组为220.33g,两组比较无统计学差异(P=0.888),至腹腔气雾化疗后第2周,实验组裸大鼠体重为258.65g,对照组为254.78g,两组比较无统计学差异(P=0.780),从气雾化疗后第3周开始,实验组裸大鼠体重增长速度显著大于对照组,实验组裸大鼠体重为275.67g,对照组为261.62g(P=0.007),至气雾化疗后第5周,实验组裸大鼠体重为301.20g,显著高于对照组279.55g(P=0.035)；7、血生理和血生化结果腹腔气雾化疗前后两组裸大鼠WBC、RBC、HB、PLT、ALT及AST均无统计学差异(P>0.05)；8、裸大鼠解剖情况两组裸大鼠均未见明显腹水,致瘤的裸大鼠肿瘤结节主要分布于肠道浆膜面及腹壁上肿瘤细胞注射穿刺点,灰白色,大小不等,部分裸大鼠在腹膜、肠系膜等部位也可见肿瘤结节。光镜下癌巢中可见腺腔样结构,由浸润性生长的癌组织构成,癌细胞大小不等,异型性明显,多见核分裂像。结论1、5-Fu气雾能有效抑制胃癌细胞的增殖并诱导凋亡,使细胞阻滞于G1期；2、5-Fu腹腔气雾化疗能有效防治胃癌腹腔种植,无明显毒副作用,安全性高,为腹腔镜胃肠癌手术中游离癌细胞种植转移的防治提供新思路,为临床上腹腔气雾化疗与腹腔镜手术同步进行的应用提供实验依据。