研究背景心血管疾病给人类健康带来巨大的威胁,其中冠心病、主动脉瘤和夹层、外周动脉闭塞性疾病等动脉病变危害尤为严重。目前动脉疾病的诊疗存在两方面问题：一是相当一部分患者出现严重并发症后才明确诊断,给治疗和预后明显增加不确定性：二是手术治疗很难将其完全根治,患者术后远期存在复发和再次手术的风险,给社会和家庭带来沉重的经济负担。尽管治疗手段不断改进,但远期疗效仍待改善。因此对动脉疾病发生的分子调控机制进行深入的研究,有助于对疾病进行早期防治,改善预后。动脉血管的组成细胞之间的相互作用对维持血管的正常形态和功能至关重要。研究表明,组成血管的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)、内皮细胞(endothelial cells, ECs)和外膜成纤维细胞(adventitialfibroblasts, AFs)之间存在复杂的信号传递,涉及的信号转导网络和机制尚未完全明确。这是由于血管既接受生物学信号的调控,也受到力学信号的影响,同时还对环境产生的化学变化进行反应,在生物、物理和化学因素共同作用下,血管的组成细胞之间所处的稳态一旦被破坏,血管疾病随之发生。细胞间的相互关系是如何被影响,其反应机制如何完成,尚待进一步研究阐明。自噬(autophagy)是一种细胞保护机制,可将胞浆成分包裹在双层膜结构的囊泡内并运送到溶酶体进行降解,从而维持细胞稳态。有研究证实自噬在延缓衰老中发挥着重要的作用,而内皮细胞的衰老正是血管老化及相关疾病产生的关键环节。基础水平的内皮细胞自噬对于血管稳态的维持非常重要,自噬失衡将会导致血管功能的失调,继而产生血管病变。在动脉粥样硬化引起的内皮细胞缺血性损伤中,机体会适度上调自噬以清除破坏的细胞器和其他代谢产物,从而延迟内皮细胞的凋亡和坏死。自噬的调节涉及多个信号通路,mTOR(mammalian target of repamycin)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)、RAS原癌基因(RAS proto-oncogene)、AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)等均参与其中。microRNA (miRNA)是一种长约19-25个碱基的非编码微小RNA。迄今为止约700多种miRNA已被证实,推测实际数量可能超过1000种。大量研究证实miRNA可在不同细胞中通过调控不同的靶点影响自噬。文献报道miRNA通过调控自噬参与肿瘤细胞的免疫逃逸机制。我们在前期实验中发现,共培养血管内皮细胞和血管平滑肌细胞可导致内皮细胞中Beclin-1表达下调,凋亡增加,而Beclin-1是自噬发生过程中的一个重要分子,因此我们推测血管平滑肌细胞可能通过旁分泌的方式对内皮细胞自噬产生调控。近年来研究发现,在活体及体外培养的细胞中,旁分泌可通过外泌体(exosomes)的分泌和摄取完成。外泌体是细胞通过胞吐作用分泌的膜性囊泡样小体,大多直径在30nm到100nm之间,可稳定存在于细胞外液中。目前认为,几乎所有的真核细胞,包括一些微生物都可以产生外泌体。随着对外泌体认识的加深,人们发现源自细胞多泡体(multivesicular bodies, MVBs)的外泌体可稳定的转运细胞因子、mRNA、miRNA和其他核酸类物质等,从而达到细胞间信息传递的目的。miR-221/222参与肿瘤发生中的血管生成,其在肿瘤中的作用受到众多研究人员的关注。随着miRNA在血管疾病中的作用研究日渐深入,miR-221/222在心血管系统的作用也逐渐被人们了解。研究表明miR-221/222参与了血管细胞的增殖、迁移和凋亡,并具有细胞特异性。同时,有文献报道miR-221在心肌梗死和心肌重构中通过调控自噬改善心肌存活。因此我们推测血管平滑肌细胞可能以旁分泌的方式调控内皮细胞自噬,这种调控可能通过分泌外泌体转运miR-221/222完成。本课题通过建立人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells, HAoSMCs)和脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)共培养的模型,模拟血管中层和内膜,研究血管平滑肌细胞来源的外泌体miR-221/222对内皮细胞自噬和凋亡的影响,以期阐明外泌体miR-221/222在内皮细胞自噬中的调控机制,并为抗内皮细胞凋亡提供新的思路。研究方法1、建立HAoSMCs和HUVECs共培养系统,观察共培养对HUVECs自噬和凋亡的影响。通过透射电镜观察HUVECs中自噬小体形成的情况。Western blot检测HUVECs的LC3I/LC3Ⅱ、ATG5、SQSTM1/p62、Beclin-1表达,流式细胞仪检测HUVECs的凋亡情况。观察共培养的]3UVECs和单独培养的HUVECs自噬基因的表达差异和HUVECs凋亡的改变。2、体外培养HAoSMCs原代细胞并传代,传至三代时收集细胞培养液,采用普通离心去除培养液中的细胞碎片,再通过超速离心、Total Exosome Isolation Reagent分离细胞培养液中外泌体,保存至-80℃备用。透射电镜观察外泌体形态并记录照片,Western blot检测外泌体的标志物CD63、CD81,并检测α-tubulin、GM130来鉴别外泌体、凋亡小体和细胞碎片。RT-PCR检测外泌体中与血管生理和病理生理密切相关的miR-126、133、150、155、181a、210、221和222的相对表达含量。3、选择相对表达含量高的四种miRNA进行后续研究,观察外泌体对HUVECs中这四种miRNA表达的影响,筛选出相对表达量改变最为显著的miRNA(miR-221/222)。体外单独或共培养HUVECs,通过加入外泌体或外泌体抑制剂GW4869进行干预,验证共培养通过外泌体调节HUVECs自噬,Westernblot检测内皮细胞自噬相关蛋白LC3I/LC3Ⅱ、ATG5、SQSTM1/p62、Beclin-1表达的差异。并观察miR-221/222抑制剂对外泌体引起的HUVECs自噬改变的调节。4、以miR-221/222为检索关键词,通过miRNA靶基因预测工具TargetScan、 PicTar和miRanda预测miR-221/222的靶基因,挑选出这些工具交集较多并有较高预测值的靶基因PTEN,采用双荧光素酶报告基因进行验证,并通过RT-PCR、Western blot分别检测PTEN mRNA和蛋白的表达,确认PTEN为miR-221/222的直接靶点。5、通过将HUVECs进行miR-221/222 mimics和inhibitors转染,观察HUVECs中PTEN的表达以及自噬相关基因表达的变化,研究miR-221/222调控HUVECs自噬的通路。RT-PCR检测转染后HUVECs中miRNA 221/222的表达情况,Western blotting检测HUVECs自噬相关蛋白LC3、ATG5、SQSTM1/p62、Beclin-1表达的差异并检测PTEN、Akt的表达。体外培养HUVECs,通过3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制miR-221/222 inhibitors诱导的自噬,再以流式细胞仪检测HUVECs的凋亡情况。6、统计学方法：本实验中所得数据采用均数±标准差计算,每组数据至少重复3次。两组间的差异比较用非配对t检验,多个组间的差异比较用ANOVA分析。通过GraphPad Prism 6软件对数据进行录入和分析,p<0.05表明具差异有显著性。研究结果1.利用Western blot检测HUVECs中自噬相关蛋白LC3、ATG5、SQSTM1/p62、 Beclin-1的表达,结果显示：共培养可以显著降低HUVECs中LC3Ⅱ、ATG5和Beclin-1的表达(p<0.01),SQSTM1/p62的表达则显著升高(p<0.01),透射电镜观察到共培养组的HUVECs自噬小体形成减少,提示与HAoSMCs共培养可抑制HUVECs自噬。流式细胞仪检测结果提示共培养增加HUVECs凋亡。2. HAoSMCs可产生富含miRNA的外泌体,其中miR-126、miR-150、miR-221/222相对表达含量较高。透射电镜观察显示外泌体为卵圆形或杯状双层膜结构小囊泡。通过软件ImageJ对外泌体的直径分布进行分析,提示外泌体的直径大多数在60-110nm之间,中位数为80rnm。同时采用Westernblot检测外泌体表面的分子标志物CD63、CD81,结果提示CD63、CD81表达较高。RT-PCR检测外泌体中的miR-126、133、150、155、181a、210、221和222的相对含量,结果表明外泌体中富含miR-126,150,155,210,221和222,其中miR-126,150,221和222的相对表达量更高。3.通过将外泌体作用于体外培养的HUVECs, RT-PCR检测其中miR-126,150,221和222的表达,并将实验组和对照组结果进行比较,提示miR-221/222表达上调更为显著(p<0.01)。体外单独或共培养HUVECs,通过加入外泌体或外泌体抑制剂GW4869进行干预,Western blot检测HUVECs中自噬相关蛋白的表达。结果表明,外泌体可抑制HUVECs中LC3Ⅱ、ATG5、Beclin-1的表达,同时SQSTM1/p62的表达上调。在共培养组中加入GW4869(可抑制细胞产生外泌体)后,共培养对自噬的影响显著减弱,其中LC3Ⅱ、Beclin-1、 SQSTM1/p62表达与对照组相比无显著差异,表明共培养的HAoSMCs通过外泌体影响内皮细胞自噬和凋亡。同时通过转染miR-221/222mimics和inhibitors到HUVECs,使HUVECs中的miR-221/222的表达上调或下调,RT-PCR检测转染后HUVECs中miR-221/222的表达,结果表明通过转染miR-221/222 mimics,可使HUVECs中的miR-221和222表达分别上调约12倍和16倍,而转染miR-221/222inhibitors则可以分别下调miR-221和miR-222至对照组的1/4和3/4。转染miR-221/222inhibitors可显著减轻外泌体引起的自噬抑制作用,提示miR-221/222参与外泌体诱导的HUVECs自噬改变。4.结合miRNA靶基因预测工具TargetScan、PicTar和miRanda的预测结果,PTEN被确定为一个miR-221/222的候选靶基因。为验证PTEN是miR-221/222的作用靶点,通过构建含有PTEN mRNA与miR-221/222结合的种子区域碱基突变的报告基因质粒并转染HUVECs,结果显示miR-221/222可抑制pGL3-PTEN-wildtype的表达,pGL3-PTEN-mutant表达无明显改变。然后以PCR和Western blot分别检测PTEN mRNA和蛋白表达,结果表明miR-221/222上调可抑制PTEN在mRNA和蛋白水平的表达,而miR-221/222下调则可以增加PTEN在mRNA和蛋白水平的表达,提示PTEN是miR-221/222直接作用的靶基因。5. PTEN可抑制蛋白激酶Akt的磷酸化,通过miR-221/222 mimics或inhibitors上调或下调HUVECs中的miR-221/222的表达,Western blot检测PTEN,LC3、 ATG5、SQSTM1/p62、Beclin-1及Akt的改变,结果表明,上调miR-221/222可抑制PTEN的表达,进而引起Akt磷酸化增加,抑制LC3Ⅱ、ATG5、Beclin-1的表达,增加SQSTM1/p62的表达。而下调miR-221/222后,PTEN表达增加,抑制Akt磷酸化,导致自噬增强。流式细胞仪检测HUVECs的凋亡,结果提示miR-221/222过表达可促进HUVECs凋亡,抑制miR-221/222表达可减轻]HUVECs凋亡。通过自噬抑制剂3-MA抑制HUVECs自噬后,后者凋亡增加。结论HAoSMCs和HUVECs共培养可下调HUVECs中LC3Ⅱ、ATG5和Beclin-1的表达水平,并增加]HUVECs中SQSTM1/p62的表达水平。HAoSMCs和HUVECs共培养可以抑制HUVECs自噬,促进]HUVECs凋亡。HAoSMCs可分泌外泌体,这些外泌体的直径在80nm左右,含有与血管系统生理和病理生理相关的部分miRNA,其中miR-126、150、221和222等miRNAs相对表达量高。HAoSMCs来源的外泌体可通过增加HUVECs中的miR-221/222来抑制HUVECs的自噬,这种抑制作用是miR-221/222通过下调PTEN的表达进而激活Akt信号实现,表明HAoSMCs分泌的外泌体miR-221/222可通过调控PTEN/Akt通路抑制HUVECs自噬。同时,抑制HUVECs自噬可增加其凋亡,提示HUVECs自噬的抑制可能对其凋亡具有促进作用。