论文部分内容阅读
方剂是中医临床防病治病的主要形式,中药复方的研究成为目前中医药研究的热点领域。复方作用于人体的生物效应模式是中药复方机制研究的关键问题之一。利用中医方剂的配伍优势及其多成分、多靶点、多途径调节的特点,探索中药复方特有的作用方式,对于揭示中医药的理论内涵和发展中医药的临床应用都有重要的意义。 本课题以CCl4肝损伤为切入点,以肝细胞为载体,把中药复方简化为几味中药单体,分别在体内和体外、细胞和整体水平上,考察了数种单体及其在各自效阈浓度条件下配伍的保肝作用。 论文分两部分。文献综述部分主要对中药复方的作用机制进行了总结,对实验中用到的四味中药单体黄芩苷、槲皮素、丁香酚、芳樟醇的药理作用进行了回顾。实验研究部分中首先确立了稳定的肝细胞损伤模型;找出四味中药单体的最低有效浓度;利用正交实验设计对四味单体进行了四因素三水平的配伍,考察了它们配伍后对CCl4肝细胞损伤的影响,分析配伍对药效结果的影响,获得体外低浓度条件下的优化成分配方;对最优配方的量效关系进行考察;最后验证了低浓度条件下优化单体配方对小鼠肝损伤整体模型的治疗作用。 研究一 BRL-3A大鼠肝细胞CCl4肝损伤模型的建立 方法:将大鼠肝细胞分为正常组、5mmol/L CCl4组、10mmol/L CCl4组、15mmol/L CCl4组、20mmol/L CCl4组,加入相应浓度的CCl4。再分别培养3h、6h、12h、24h、48h后,吸出上清液,测ALT。剩余细胞采用MTT法测细胞增殖率。结果:与正常对照组比较,5mmol/L CCl4组、10mmol/L CCl4组、15mmol/L CCl4组、20mmol/L CCl4组在作用3h、6h、12h后,ALT值均显著增高（P<0.05）。10mmol/L CCl4组、15mmol/L CCl4组、20mmol/L CCl4组在作用24h后,ALT值也均有明显增高（P<0.05）。5mmol/L CCl4组在作用24h后,与正常对照组比较,ALT值没有显著增加。5mmol/L CCl4组、10mmol/L CCl4组、15mmol/L CCl4组、20mmol/L CCl4组在作用48h后,ALT值没有明显增加。与正常对照组比较,5mmol/L CCl4组、10mmol/L CCl4组、15mmol/L CCl4组、20mmol/L CCl4组在作用3h、6h、12h、24h后,肝细胞增殖率均无明显改变。5mmol/L CCl4组、10mmol/L CCl4组在作用48h后,肝细胞增殖率有显著增加（P<0.05）。15mmol/L CCl4组、20mmol/L CCl4组在作用48h后,肝细胞增殖率亦无明显改变。结论:选用15mmol/l的CCl4作用24h能引起细胞损伤但对增殖率无明显影响,选为复制体外肝细胞损伤模型的条件。 研究二 黄芩苷、槲皮素、丁香酚、芳樟醇体外保肝作用及其最低有效浓度研究效闽浓度下中药多成分的生物效应模式 方法:分别设正常对照组、15mmol/L CCI;模型组、及每一味单体的几个浓度组,各剂量组同时加入CCI;及相应剂量的中药单体,测定24h后细胞培养液中ALT并测其细胞增殖率。各批实验结果:黄芬昔实验中,与正常组比较,模型组的ALT均有显著差异;与模型组比较,除G组外,D、E、F、H、I、J组的ALT均有显著差异（P<0.05）;A、B、C组的ALT水平无显著差异（P>0.05）。与模型组比较,正常组、A、B、C、o、E、F、G、J组的MTT均无明显差异（P>0.05）;与模型组比较,H、I组的MTT与模型组显著增高（P<0.05）。棚皮素实验中,与正常对照组相比,模型组的ALT水平有明显升高（P<0.05）。与模型组相比,懈皮素各浓度组的ALT水平均无明显降低（P>0.05）。与模型组相比,sx一。一‘mmo一/ml剂量组、2 x 10‘6 mmol/ml组的细胞增殖率有明显增加（P<0.05）;3.2 x 10一gmmol/ml组、l.6xlo一smmol/ml组、4x 10一7 mmol/m1组的细胞增殖率无显著改变（P>0.05）。丁香酚实验中,与正常对照组相比,模型组的ALT水平有显著升高（P<0.05）。与模型组相比,浓度为sx10一mmol/ml的丁香酚组ALT水平有显著降低（P<0.05）。与模型组相比,各剂量组的丁香酚对细胞增殖率无显著影响（P>0.05）。芳樟醇实验中,与正常对照组相比,模型组的ALT水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比,浓度为5 x 10一smmol/ml的芳樟醇剂组ALT水平显著降低（P<0.05）。与模型组相比,各个剂量组的芳樟醇对细胞增殖率无显著影响（P>0.05）。结论:黄答昔的最低有效浓度为3.2xlo.gmmol/m1。棚皮素在实验所选的剂量范围内无保肝作用。丁香酚及芳樟醇的最低有效浓度均为sx10一smmol/ml。 研究三效阂浓度以下四种成分配伍的体外保肝效应 方法:按照四因素三水平正交设计表分组并加药后,取细胞上清液测ALT,剩余细胞按研究二中的方法测细胞增殖率。结果:与正常组相比,模型组的ALT水平有显著升高（P<0.05）。与模型组相比,第3组、第4组、第5组、第7组、第9组、第n组的ALT水平显著降低（P<0.05）。第6组、第8组、第10组的ALT水平无显著差异（P>0.05）。各组的细胞增殖率之间无显著差异（P>0.05）。结论:第9组（四单体一水平组）配方为最优配方。 研究四低浓度条件下的优化成分配方的量一效关系 方法:以研究三中的最优化配方依次稀释2倍,4倍,8倍,16倍,32倍,总共设六个剂量组,细胞种板,加药方法同前,取细胞上清液测ALT,剩余细胞测细胞增殖率,方法同前。结果:与正常对照组比较,模型组的ALT水平有显著升高。与模型组比较,最优化配伍组与1/2剂量组的AL