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目的:探讨辅酶Q10脂质体(Coenzyme Q10 liposome,Co Q10-lip)对大鼠肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的保护作用及其可能的作用机制;运用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽(Arginine-glycine-aspartic acid peptide,RGD)靶向纳米泡和普通纳米泡进行对比,结合超声造影,评价靶向纳米泡对于大鼠肾IRI的评估效果和靶向性。方法:1 Co Q10-lip对于大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制(1)利用薄膜水合法制备Co Q10-lip。(2)建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型,随机分为N组(假手术组)、B组(模型组)、C组(Co Q10水溶液组)、G组(Co Q10-lip组),所有动物行右肾切除术;其中N组分离左肾动脉不夹闭,B、C及G组夹闭左肾动脉45分钟;再灌注30分钟后,C组给予Co Q10水溶液,G组给予Co Q10-lip,0.5ml含Co Q10 3mg(15mg/kg),B组给予相同体积的生理盐水尾静脉注射。24h后处死动物。(3)取血检测大鼠肾功能变化,石蜡切片评估肾小管坏死程度,ELISA检测肾组织中的SOD、MDA、MPO及TNF-α含量,Westernblot检测肾组织中的bcl-2、Bax、Caspases-3、NF-ΚB,石蜡切片TUNEL染色评估细胞凋亡程度,在术前和术后24h进行大鼠肾脏超声检查及MRI检查。2 RGD纳米泡靶向超声评价大鼠肾脏缺血再灌注损伤的实验研究(1)采用薄膜水合法制备空白磷脂纳米泡及RGD磷脂纳米泡。(2)选择缺血再灌注大鼠随机分为两组,空白纳米泡组、RGD磷脂纳米泡组。术后24h经尾静脉团注以上两种造影剂。1分钟后待造影剂完成蓄积,空化击破纳米泡,比较击破前后纳米泡数量,即造影图像db变化。(3)免疫组化检测大鼠肾脏缺血再灌注损伤中αvβ3整合素表达3统计学方法:借助SPSS软件20.0对数据进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 Co Q10-lip对于大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制(1)组织病理学改变:大鼠肾脏组织光镜下均可见到肾小球无明显异常,手术组大多数肾小管特别是近髓质部肾小管上皮细胞出现崩解、坏死、脱落,管腔内可见细胞碎片及管型。肾小管坏死评分显示B组较N组有明显升高(t=-35.35,P<0.001),两个治疗组较B组均有明显下降,差异有统计学意义,C组VS B组,t=3.21,P=0.01;G组VS B组,t=6.5,P<0.001,且G组的与C组相比有统计学意义(t=2.68,P=0.02)。(2)血清学改变:B组大鼠的肌酐和尿素较N组出现明显升高(125.83±64.39VS 26±2.45μmol/L),t=-3.8,P=0.01;(26.32±13.87 VS 3.75±0.76mmol/L),t=-3.98,P=0.01。应用Co Q10-lip明显减轻了缺血再灌注大鼠肾功能的恶化,G组肌酐和尿素与B组相比有统计学意义(41.17±7.19 VS125.83±64.39μmol/L),t=-3.2,P=0.02;(10.1±2.37 VS 26.32±13.87mmol/L),t=-2.8,P=0.04;水溶性Co Q10虽然也降低了肌酐和尿素的数值,但结果没有统计学意义,肌酐(65.5±15.29 VS125.83±64.39μmol/L),t=2.33,P=0.06;尿素(19.93±2.69 VS 26.32±13.87 mmol/L),t=1.34,P=0.23。(3)ELISA检测肾组织中的SOD、MDA、MPO及TNF-α含量改变:肾IRI时SOD浓度下降,MDA、MPO及TNF-α浓度升高,Co Q10能够减缓SOD浓度降低、抑制MDA、MPO及TNF-α浓度升高而缓解肾IRI,以Co Q10-lip作用更明显。肾IRI后,G、C、B组SOD浓度与N组相比均减低,以B值降低最明显,(408.83±6.46 VS 559.43±15.81 ng/ml),t=17.64,P<0.001;C组和G组均明显减轻了SOD浓度的下降,(424.77±5.78 VS 408.83±6.46 ng/ml),t=-3.68,P=0.01;(454.73±13.86 VS408.83±6.46 ng/ml),t=6,P<0.001;且G组与C组相比,差异具有统计学意义(t=-4,P<0.001)。肾IRI后,G、C、B组MDA浓度与N组相比均升高,其中以B组最为明显(1225.27±51.95 VS 726.62±19.75nmol/L),差异具有统计学意义(t=-17.93,P<0.001);MDA的浓度C组1043.59±42.35 nmol/L及G组869.50±50.02 nmol/L较B组差异具有统计学意义,t=5.42,P<0.001;t=9.87,P<0.001,且G组的作用更为明显,G组与C组比较有明显差异,t=5.31,P<0.001。MPO浓度B组30.52±0.88 ng/ml与N组19.24±0.86ng/ml相比升高,差异具有统计学意义(t=-18.33,P<0.001);C组或者G组均明显抑制了MPO浓度的升高,(27.04±1.17 VS30.52±0.88 ng/ml),t=4.76,P<0.001;(21.48±0.97 VS 30.52±0.88 ng/ml),t=-3.49,P=0.01,且G组的作用更为明显,与C组比较有明显差异,t=7.32,P<0.001。B组较N组TNF-α的浓度明显升高(249.74±8.31 VS 134.78±8.74pg/ml),t=-19.6,P<0.001。C组或者G组均明显抑制了TNF-α浓度的升高,(217.52±9.99 VS 249.74±8.31 pg/ml),t=4.97,P<0.001;(181.32±7.56 VS249.74±8.31 pg/ml),t=12.18,P<0.001;且G组的作用更为明显,与C组比较有明显差异,t=5.78,P<0.001。(4)Western blot检测肾组织中的bcl-2、Bax、caspase-3、NF-ΚB:肾脏发生缺血再灌注损伤后,促进凋亡因子Bax及caspases3明显增加,Co Q10水溶液和Co Q10-lip均抑制了促凋亡因子的增加,其中G组较C组的表现更为明显。而抗凋亡因子Bcl-2则在缺血再灌注损伤发生后表达下降,Co Q10水溶液和Co Q10-lip均延缓了Bcl-2下降,其中Co Q10-lip的作用更为明显。缺血再灌注损伤后,肾组织NF-κB的表达也呈现增加的趋势,Co Q10水溶液和Co Q10-lip均抑制了NF-κB的增加。(5)TUNEL分析显示正常组肾组织偶见零星细胞凋亡,缺血再灌注损伤明显增加了肾组织的细胞凋亡,Co Q10水溶液和Co Q10-lip均明显抑制了肾脏的细胞凋亡。(6)超声检查显示再灌注24小时后B、C、G组PSV及RI值较N组升高,差异均有统计学意义。但B、C、G组间差异无统计学意义。肾皮质TIC曲线分析,N组呈快速上升达峰,快速降低。B、C、G组曲线上升及下降均缓慢,尤以下降为甚,提示血流淤滞;G组的AUC、TTP、Grad较B、C组均有一定改善,但差异无统计学意义。(7)MRI显示大鼠肾IRI后24h外髓外带(OSOM)呈明显的高信号(OSOM的SSI值升高),除N组外各组的术前与术后24h之间OSOM的SSI值差异具有统计学意义(P<0.05),术后24h B组、C组、G组之间OSOM的SSI值均无统计学意义(P>0.05)。DCE-MRI检查示肾IRI对比剂由肾皮质进入肾髓质时间延长,以B组延迟时间最长,G组进入增强时间较B组改善,但仍较N组缓慢。B组、C组术后24h kcl较术前明显降低,差异具有统计学意义,而G组大鼠术前与术后相比kcl无明显差异,且与N组相比术前及术后24h差异均无统计学意义。2 RGD纳米泡靶向超声评价大鼠肾脏缺血再灌注损伤的实验研究(1)RGD靶向磷脂纳米泡,空化前后造影剂图像灌注强度有所差异,击破前灌注较强,而空化击破后亮度有所减低。RGD磷脂纳米泡与空白磷脂纳米泡空化前后db差值存在统计学差异(P=0.009),说明RGD靶向纳米泡对于肾脏缺血再灌注损伤具有靶向超声显影。(2)缺血再灌注损伤后肾脏有αvβ3整合素高表达,而正常肾脏低表达。结论:1.肾IRI后,肾小管明显坏死,肾组织SOD浓度下降,MDA、MPO及TNF-α浓度升高,凋亡因子表达增加,炎症因子表达增加;Co Q10-lip能够减缓SOD浓度降低、抑制MDA、MPO及TNF-α浓度升高而缓解肾IRI。Co Q10-lip在分子水平上通过抑制氧化应激、减少细胞凋亡,减轻炎症反应等机制来减轻肾脏的缺血再灌注损伤,且其作用明显优于单纯Co Q10水溶液。2.MRI能够敏感显示肾IRI改变。T2WI示IRI后肾组织特别是肾外髓外带(OSOM)信号强度增加,对比剂从肾皮质进入肾髓质时间延长,肾脏清除能力降低,Co Q10-lip能缓解肾IRI,在DCE-MRI图像上有所显示。3.RGD肽作为整合素和其配体相互作用的识别位点,能够识别肾IRI时高表达的整合素αvβ3,介导细胞与细胞外基质之间相互作用,靶向识别结合位点,利用RGD靶向纳米泡进行超声造影可以更有效的评估大鼠肾脏IRI。