心肌梗死(Myocardial infarction,MI)仍然是全球发病率和致死率最高的疾病之一。心肌梗死发生后,功能性心肌细胞逐渐丧失,诱发机体产生炎症反应,招募骨髓及外周血中单核/巨噬细胞至梗塞区,清除死亡细胞及细胞外基质碎片。单核/巨噬细胞系统广泛参与了机体炎症反应、抵御微生物入侵和组织器官重塑等过程。我们前期工作发现脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激下的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体对小鼠心肌梗死有明显的改善作用,其对单核细胞亚群是否也有调控作用是我们关注的重点。小鼠体内循环单核细胞可以根据Ly6C表达分成2个亚群,Ly6ChighCCR2+CX3CR1_和 Ly6ClowCCR2-CX3CR1+亚群。Ly6Chigh 为炎症性细胞亚群,分泌促炎因子如IL-6,在炎症初期能起到清除细胞碎片的作用;Ly6Clow为抗炎性细胞亚群,表达高水平的抑炎因子如IL-10,在疾病修复期发挥积极的抑制炎症和促进瘢痕修复的作用。在心脏、肝脏和肾脏发生炎症性疾病初期,骨髓和脾脏产生的Ly6Chigh单核细胞增多,而疾病后期Ly6Clow单核细胞数量增多,预示着Ly6C单核细胞亚群可能是一群特异性的效应细胞。对于Ly6C单核细胞亚群的来源及其在心脏疾病中的作用,目前尚需进一步探究。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有强大的临床治疗潜力,已被证明能够修复受损心脏功能的恢复并促进受损心脏组织中的血管生成。大量研究表明,MSCs可以通过旁分泌机制优化组织微环境、减少炎症并促进受损组织修复,而MSCs分泌的外泌体(exosomes)在这一过程中可能发挥重要作用。在正常或病理条件下,外泌体均能携带来源细胞中多种脂质、蛋白质、mRNA和非编码RNA,介导细胞、组织和器官之间的信息交流,调节细胞的活性并可能对细胞的表型进行转化。Exosomes内容物中的miRNAs,已被证实在心梗等心肌缺血性疾病中起着重要的调控作用。在炎症环境中,exo-miRNAs可以促使Treg细胞分化,使Ml促炎性巨噬细胞转化为M2抗炎性巨噬细胞。但是MSCs产生的exosomes对Ly6C单核巨噬细胞亚群的影响尚不清楚。其中的miRNAs在这个过程中又发挥了怎样的角色?针对上述问题,本研究采用LPS感染细胞炎症模型,探究LPS刺激下MSCs分泌的exosomes的特点以及这些外泌体是否可以转换骨髓来源Ly6C单核细胞的亚群,并进一步研究其中发挥关键作用的miRNA及其作用机制。研究方法:1.梯度离心法分离获得原代人骨髓间充质干细胞,通过细胞形态、表面标记及成骨成脂诱导分化能力进行鉴定。纳米颗粒跟踪分析仪和透射电镜,测定了 exosomes的粒径分布、浓度及形貌结构;量化成像分析流式细胞仪鉴定其表面标记(CD9、CD63、CD81);Western blot 鉴定其他蛋白标记(Alix、HSP70、Flotillin-1);2.比较不同炎症因子处理的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与非处理组分泌exosomes大小和数量的差异;外泌体与单核细胞共培养,流式细胞术检测Ly6C细胞亚群比例变化并选取合适的刺激浓度,RT-qPCR检测相关因子的改变,ELISA检测细胞上清炎症因子的变化。3.对正常BMSCs分泌exosomes和LPS刺激后BMSCs的exosomes进行miRNAs测序,对测序结果进行分析,找寻其中具有显著性差异的miRNAs,对靶基因进行GO和KEGG分析,初步说明BMSCs外泌体对单核细胞表型转换的潜在机制。结果1.将梯度离心法获得的骨髓细胞进行贴壁培养,培养约7-10天,细胞呈长梭状,聚集呈旋涡状克隆生长,继续进行传代培养。实验所用BMSCs为3-8代细胞。成脂诱导分化后油红O染色,可见细胞内有红色脂滴分布,成骨诱导分化后茜素红染色可见橘红色钙结节形成。流式细胞术鉴定结果显示:骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166为阳性表达,而造血系表面标志物CD31,CD34,CD45为阴性。BMSCs来源的exosomes,流式成像细胞仪定性检测表面跨膜蛋白CD9、CD63、CD81均为阳性,并拍到带有荧光标记的纳米粒子图片,透射电镜检测到直径在100nm左右的双层膜囊性小泡,Nanosight测得exosomes的粒径主要分布在30-100nm中,多数颗粒的粒径约为 69.2nm,浓度为 6.67 × 109 士 1.36 × 108 个/mL,Western Blot 分析发现,我们所提取出的exosomes阳性表达Alix、HSP70、Flotillin-1等蛋白。2.LPS刺激BMSCs产生的外泌体能明显改变Ly6C单核细胞亚群比例,经Nanosight检测粒径分布和浓度,LPS刺激后细胞产生外泌体(LPS preconditioned mesenchymal stem cells derived exosomes,LPS-exo)的数量多于正常情况下细胞分泌的外泌体(Normal mesenchymal stem cells derived exosomes,Nor-exo),且有显著性差异[(3.58×1012±6.12X 107)vs(7.75×1011 ±2.06×107)particles·L-1,P<0.01],但直径没有明显改变。流式结果显示,与Nor-exo组相比,LPS-exo明显增加Ly6Chigh单核细胞的比例,而减少Ly6Clow单核细胞比例,差异均具有统计学意义。RT-qPCR和ELISA结果均显示LPS-exo明显增加了促炎因子IL-6的表达水平,趋化因子CCL2和CX3CL1和抗炎因子IL-10,TGFβ的表达水平也有一定的提升,但均没有促炎因子效果明显。3.测序结果表明,LPS可以改变外泌体中miRNA的种类,其中选取差异显著的miRNA,预测其靶基因参与多种生物功能以及多条信号通路的调节,也参与了与炎症密切相关的Akt、mTOR等信号通路。Westm blot检测发现LPS-exo可以刺激单核细胞中TLR4的表达,表明TLR4可能参与了外泌体对单核细胞亚群的调控作用。结论:1.我们成功分离BMSCs,且提取出BMSCs分泌的exosomes。2.LPS刺激BMSCs产生的外泌体能明显改变Ly6C单核细胞亚群的比例,且Ly6Chigh单核细胞比例上升,Ly6Clow单核细胞亚群比例下降,LPS-exo增加了促炎因子IL-1β,IL-6和抗炎因子IL-10,TGFβ的表达水平,促炎因子的上调比例明显,提示外泌体对Ly6Chigh单核细胞和Ly6Clow单核细胞均有一定调节作用,主要促进了 Ly6Chigh细胞亚群分泌促炎因子。趋化因子CCL2和CX3CL1的表达水平上调,提示外泌体有可能增强单核细胞的趋化功能,促使骨髓中的Ly6C单核细胞进入血液循环到达炎症部位发挥相应作用。3.LPS可改变BMSCs细胞分泌外泌体的miRNA种类,参与了与炎症密切相关的Akt、mTOR等信号通路。TLR4作为炎症信号通路上游中的关键因子以及LPS的经典受体,在单核细胞中与LPS-exo共培养后显著上调,说明外泌体携带了 LPS刺激后母体细胞BMSCs的遗传信息,传递到单核细胞后上调TLR4的表达,激活相应炎症通路,促使炎症因子释放,进而增加促炎型Ly6Chigh单核细胞比例。因此,本研究主要阐明了 LPS刺激下骨髓间充质干细胞来源的可以改变Ly6C单核细胞亚群比例,传递miRNA到单核细胞中调控TLR4表达,通过炎症信号传导通路最终影响Ly6C单核细胞亚群的改变,本研究初步探讨了炎症微环境中BMSCs对单核细胞表型转换的影响,为MSCs在免疫调节中的旁分泌作用提供了新的思路,外泌体可以作为新的靶点来调整机体免疫应答,为临床炎症性疾病的治疗提供一种新的治疗策略。