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由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RB SDV)引起的水稻黑条矮缩病是我国禾本科粮食作物上一种重要病毒病,每年造成巨大的粮食损失。RBSDV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus),在田间通过灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)以持久增殖型方式传毒,不能通过汁液摩擦传播。RBSDV病毒基因组由10条线性双链RNA构成(S1-S10),其中S10编码了病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)。已有研究表明病毒的外壳蛋白在介体传播病毒的过程中发挥重要作用,那么RBSDV的CP在灰飞虱传播RBSDV过程中的具体功能和作用机制是什么?这些科学问题的解析对阐明水稻黑条矮缩病的流行规律并建立科学防控体系具有重要意义。为此,本论文对RBSDV CP蛋白与其灰飞虱介体之间的分子互作机理进行了研究,并取得如下研究结果:1)与RBSDV外壳蛋白互作介体因子的筛选为了明确RBSDV CP在病毒依赖介体传播中的功能,以RBSDV CP蛋白为诱饵,利用酵母双杂交实验对灰飞虱cDNA文库进行筛选,得到17个灰飞虱基因片段,这些基因涉及多种生物学过程。经过全长扩增和酵母回转互作验证后,得到5个与RBSDV CP互作的灰飞虱蛋白:活化的蛋白激酶C受体1(Receptor for activated protein kinase C,RACK1)、表皮蛋白 CPT3(Cuticular protein tweedle motif 3,CPT3)、前胶原赖氨酸-1,2-酮戊二酸-5-双加氧酶 3(Procollagen-lysine 1,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3-like,PLOD)、prefoldin subunit 2-like protein、paxillin-like isoform 2。2)RBSDV外壳蛋白与灰飞虱LsRACK1互作机理研究RACK1是由7个WD40结构域组成的支架蛋白,参与多种信号分子的传递。利用Co-IP和体外实验GST Pull-down进一步验证了 RBSDV CP能够与灰飞虱LsRACK1 直接互作。根据(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)网站预测的RBSDVCP蛋白跨膜结构域并构建缺失突变体。酵母双杂交实验结果表明CP与LsRACK1互作的关键位点在CP蛋白N端的1-270位(muCP-N)和LsRACK1的C端268-315位氨基酸。利用qRT-PCR对LsRACK1时空表达模式进行分析,发现LsRACK1在四日龄灰飞虱及精巢中表达水平最高。利用qRT-PCR和Western blot分析了带毒与非带毒灰飞虱成虫中LsRACK1基因表达水平,发现LsRACK1基因的转录和蛋白表达水平在带毒与非带毒灰飞虱中没有差异。利用组织免疫荧光技术发现RBSDV CP和LsRACK1在带毒灰飞虱的中肠、卵巢滤泡细胞、精巢中都存在共定位。激光共聚焦观察发现RBSDV CP在昆虫细胞Sf9中表达后在细胞质中形成颗粒状的聚集体,并且与内质网定位标记HDEL-mCherry有共定位,而单独表达的LsRACK1定位于细胞质和细胞膜上,且有部分聚集成团,与HDEL-mCherry没有共定位。当RBSDVCP与LsRACK1在Sf9细胞中共表达时,发现两者共定位于细胞质中的颗粒状结构。进一步通过膜悬浮实验表明,RBSDVCP与LsRACK1的互作发生在内质网上,且RBSDVCP能够改变LsRACK1的亚细胞定位,将其从细胞质和细胞膜转移至内质网。已有的研究表明RACK1是蛋白激酶C(PKC)的受体,参与调控PKC的转位与活性。对RBSDV带毒与非带毒灰飞虱中PKC活性进行了分析发现,带毒灰飞虱体内的PKC活性低于不带毒灰飞虱。另外,表达RBSDV CP及其N端突变体(muCP-N)的Sf9细胞内的PKC活性也均比表达GFP对照组低,说明RBSDV CP和N端突变体的表达减弱了 PKC激酶活性。为了进一步研究了 PKC激酶活性对病毒侵染灰飞虱体的影响,将PKC特异的抑制剂及激活剂显微注射灰飞虱进行PKC激酶活性的抑制和激活,然后进行饲毒和体内病毒检测。结果发现PKC激酶抑制剂处理后灰飞虱体内病毒的积累水平提高,而激活剂处理后灰飞虱体内病毒的积累水平下降。利用dsRNA诱导的基因沉默降低灰飞虱体内LsRACK1表达后,PKC激酶活性下降,且灰飞虱携带RBSDV病毒的比率提高。这些结果表明LsRACK1参与了昆虫介体的抗病毒反应。RACK1在正常细胞中能够增强PKC介导的磷酸化,推测RBSDV带毒的灰飞虱体内PKC激酶活性降低可能是由于CP与LsRACK 1的互作影响了 LsRACK1蛋白的正常定位而使RACK1功能受阻进而减弱了 PKC的活性。另外发现RBSDV CP的N端1-270位氨基酸是影响LsRACK1功能、抑制PKC激酶活性的关键部位。3)RBSDV外壳蛋白表达诱导细胞自噬细胞自噬是一种高度保守的细胞内蛋白质再循环机制,可能参与病毒的侵染过程。对RBSDV病毒侵染不同时间点的灰飞虱中肠中的自噬情况进行激光共聚焦和电镜观察,发现在病毒感染2d后中肠上皮细胞发生明显的自噬,4 d后自噬水平降低,病毒积累增加。利用膜饲喂法对灰飞虱进行自噬激活剂雷帕霉素处理,发现处理组灰飞虱体内病毒的积累水平与饲喂人工饲喂液对照组相比明显降低;通过沉默灰飞虱自噬相关基因ATG3、ATG5、ATG8及饲喂自噬抑制剂3-MA发现,自噬相关基因沉默和饲喂自噬抑制剂处理组灰飞虱体内病毒的积累水平比对照组显著提高。这些结果表明自噬参与灰飞虱抗病毒作用,自噬在灰飞虱抵御病毒侵染中发挥重要作用。为了明确RBSDV CP是否是病毒在灰飞虱中引起自噬的诱因,在Sf9中表达RBSDV CP,透射电镜观察发现表达RBSDV CP蛋白的Sf9细胞能够引起自噬。对灰飞虱部分自噬基因进行扩增,并用酵母双杂交实验发现RBSDV CP能够与ATG3发生互作。表明RBSDV CP是该病毒在灰飞虱中引起自噬的诱因。综上所述,RBSDV CP蛋白与灰飞虱介体的互作是一个复杂的生物学过程,一方面,病毒侵染后RBSDV CP通过与LsRACK1蛋白互作,改变LsRACK1的定位,减弱PKC激酶活性从而抑制昆虫介体的防卫反应,以利于病毒的侵染;另一方面,RBSDV CP的表达诱导灰飞虱细胞产生自噬,激活昆虫细胞的免疫反应来应对病毒的侵染。