禽白血病(Avian Leukosis,AL)是指由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒(ALV)引起的鸡的各种可传播的良性和恶性肿瘤。ALV主要侵害宿主的免疫细胞,造成鸡体免疫抑制,造成其他病原继发感染。J亚群是90年代初从肉鸡中分离到的ALV,现在已经迅速蔓延到很多国家,我国关于ALV感染的报道也很多,给我国养鸡业造成了巨大经济损失。近年来,被命名为K亚群的ALV陆续从中国的不同地方品系鸡群中分离出,但这些中国分离株的致病性仍有待进一步研究。鸡球虫病是一类由专性细胞内寄生的艾美耳属原虫引起的鸡肠道原虫疾病。艾美耳属入侵宿主肠上皮细胞,损害肠道的完整性和肠粘膜免疫,所以感染鸡经常存在与肠道内的其他寄生虫、细菌以及各种病毒的共感染现象。E.tenella是其中致病性最强的虫种之一,主要寄生在盲肠上皮细胞内。球虫在环境中无处不在,高达90%的鸡群中有球虫的存在,并且有大量鸡感染球虫。如果该病原的感染未能有效控制,往往造成高死亡率。鸡群中不同病原(细菌、病毒、或是寄生虫)共感染的现象十分普遍,尤其是在发病鸡群中病原共感染的比例很高,这往往导致它们对鸡体的致病性增强。病原共感染的现象对于疾病的诊断和防控是个极大的挑战。鉴于ALV和球虫都是鸡群中常见的病原,对感染鸡都造成免疫损伤,同时都存在与其他病原共感染的现象,关于这两种病原共感染的现象未见报道,本课题开展对ALV和鸡球虫的共感染研究,分析它们共感染的现状和致病性,并试图通过高通量技术阐明不同病原共感染致病调节的分子机制。肠道微生物区系十分复杂,含有丰富多样的菌群,肠道微生物基因组被誉为宿主的“第二基因组”。肠道菌群不仅在机体的消化、吸收和营养方面发挥重要作用,还能够刺激肠道上皮细胞发育,帮助塑造肠道免疫功能,各种生理和心理健康问题也与肠道菌群的紊乱有关,所以近年来肠道菌群的功能越来越受到科研工作者的重视。鸡盲肠是鸡体内微生物区系最复杂的器官,1克(g)盲肠内容物(湿重)大约含有1011的细菌,其中包括很多条件致病菌,当鸡体免疫功能改变后,这些条件致病菌为继发感染提供了大量的资源。通过宏基因组学直接抽提样本中的宏基因组进行高通量测序和生物信息学分析,相比传统的依赖于培养的方法能够同时检测肠道内整体的菌群分布。通过高通量技术解析病原感染后肠道菌群的变化可能有助于我们阐明病原的致病机制。后基因组时代,蛋白质作为生物功能的执行者已经成为生命科学领域的研究热点。蛋白质组学是对机体器官、组织或细胞的全部蛋白质的表达水平、蛋白修饰、蛋白之间的相互作用与功能等进行高通量筛选和分析,比传统的单个蛋白的研究更能准确反映机体的整体状态。因此作为一种全新的系统生物学研究方法,蛋白质组学技术为筛选病原感染中可能发挥关键作用的差异蛋白,并进一步揭示致病机理提供了强有力的帮助。1.鸡群中alv和球虫共感染现状的流行病学调查本研究通过病原学检测结合分子生物学技术进行鸡群中alv和球虫共感染现状的流行病学调查,结果显示,在我们调查的范围内(山东济宁、泰安肥城和新泰),所有地区的大部分鸡场样品都检出球虫,个别鸡场的样品球虫检出率高达90%,而只有来源于泰安肥城不同鸡场的样品检出alv,阳性率高达33.3%,扩增gp85序列测序发现均为alv-j感染。经统计发现泰安市肥城地区alv和鸡球虫共感染的比例达13.33%。本研究首次证实鸡群中确实存在alv和球虫共感染的现象。2.alv分离株js11c1的全基因组测序、传染性克隆构建及其生物学活性分析将中国地方品种鸡alv分离株js11c1的全基因组测序,构建其传染性克隆,并将它的全基因组序列和部分作用元件与genbank中已经发表的其它的alv进行比较。结果显示js11c1基因组全长7707bp,基因组结构属于典型的复制完整型的c型反转录病毒,不含有肿瘤基因。传染性克隆拯救出的病毒复制能力和生物学活性与母本病毒一致。基于整个基因组的序列比较结果进一步确定js11c1及其它几个alv毒株与其它已知的亚群同源性比较低,可以分类为一个新的亚群k。本研究基于js11c1整个基因组序列与已知alv六个亚群的同源性比较,为k亚群的建立提供了分子依据,并从基因组水平进一步确立了它的分类地位;首次构建了该类alvs的传染性克隆,为进一步进行这类病毒的体外生物学活性研究、基因组结构和功能以及致病的分子机制提供平台。3.不同亚群alv与e.tenella共感染对不同品种鸡的致病性分析本研究进行不同亚群alv(j:rnx0101和k:rjs11c1)与e.tenella共感染对不同品种鸡(spf鸡、海兰褐蛋鸡和aa肉鸡)的致病性分析。结果显示不同亚群alv分别和e.tenella共感染后不同品种鸡死亡率都明显增加,鸡体重减轻。alv感染加快球虫疾病病程,e.tenella感染延长alv感染鸡的病毒血症。与单一病原感染鸡和健康鸡相比,共感染鸡胸腺萎缩、对感染病原和ndv灭活苗的体液免疫水平降低、外周血中淋巴细胞亚群以及全身和局部细胞因子转录水平紊乱。结果表明不同亚群alv与e.tenella共感染在对不同品种鸡的致病性都具有一定的协同作用。4.alv和e.tenella共感染对鸡盲肠菌群的影响通过分析alv和e.tenella感染后鸡盲肠菌群的变化揭示不同病原感染及共感染的致病机制。ALV感染均引起盲肠菌群多样性增加,共生菌的大量缺失,很多条件致病菌显著富集,不同亚群ALV感染引起不同条件致病菌的富集。E.tenella感染对鸡盲肠菌群最显著的影响是造成盲肠肠道菌群结构极大程度的改变,多样性和丰富度急剧降低,与ALV感染类似,大部分常驻菌急剧缺失,同时引起大量条件致病菌的显著富集。r-NX0101和E.tenella共感染的鸡体内盲肠菌群呈现多元性变化,感染情况介于球虫单独感染和AJ感染之间,并且造成某些菌在个体中的增殖;而r-JS11C1和E.tenella共感染有明显的协同作用,尤其是对一些条件致病菌的进一步富集,导致鸡体继发细菌感染的几率增加,这可能与共感染致病性增加有关。5.不同亚群ALV与E.tenella共感染对鸡脾脏蛋白组的影响利用iTRAQ技术对不同亚群ALV分别和E.tenella共感染鸡脾脏以及健康鸡脾脏蛋白质进行了定量蛋白质组学研究,共鉴定蛋白质1737个。对鉴定的脾脏蛋白质进行了功能注释发现大部分蛋白参与基本的生物学代谢过程,并且有很多蛋白参与免疫相关的生物过程,注释到不同的病原感染和各种疾病相关的通路中。其中r-NX0101感染主要影响了宿主的转录、翻译以及翻译后修饰等相关的功能,以及与肿瘤形成与迁移密切相关的基质粘附蛋白的表达,这些差异蛋白可能与J亚群ALV的致肿瘤特性密切相关;r-JS11C1感染主要是富集翻译后修饰相关的宿主功能蛋白;E.tenella感染主要是由于其虫体入侵影响宿主的细胞组织结构;r-NX0101和E.tenella共感染则对具有细胞溶解功能蛋白的富集最为显著,并且还有一些差异蛋白参与到重要的免疫学相关的代谢通路;而r-JS11C1和E.tenella共感染则主要影响应激和神经系统疾病相关蛋白的表达。这将为阐明共感染致病机理提供新思路和理论依据,增加我们对病原与宿主相互作用的认识。