贫血是临床上最为常见的症状之一,可以并发于很多疾病。在2010年,全世界约有32.9%的人患有不同程度的贫血,且每年有上千万人由于贫血所引致的各类疾病而死亡。因此,对贫血的治疗非常重要。复方阿胶浆（FEJ）作为一种知名的复方中药,在临床上主要用于补气补血,其确切的补血疗效逐渐受到人们越来越多的关注。近年来,虽然在动物模型和临床应用方面关于FEJ治疗贫血的研究均取得了一定的进展,但是这些研究大部分都只是大体上观察FEJ治疗贫血的效果,没有对其抗贫血活性进行特别深入和系统的研究,更没有对FEJ纠正贫血的作用机制进行相关的研究,这极大地限制了FEJ进一步的开发和应用。因此,在以往相关研究的基础上,我们通过建立3种常见贫血类型的动物模型,即肾性贫血、缺铁性贫血、骨髓抑制贫血模型,经过FEJ给药治疗后,采用现代药理学的技术和手段,以进一步观察FEJ纠正贫血的药理作用,同时从现代生物学角度在分子水平探究其相关的作用机制。本课题的主要研究内容包括以下3个方面。1FEJ对肾性贫血大鼠的治疗作用及作用机制采用灌胃腺嘌呤的方法制备肾性贫血大鼠模型。模型制备成功后,动物随机分为8组：空白对照组,模型对照组,低、中、高剂量FEJ（3、6、12mL/kg·d）组,促红细胞生成素（EPO,每3d200U/kg）阳性对照组,阿胶（300mg/kg·d）组和无阿胶复方阿胶浆（WEFF,即FEJ中除阿胶外的所有其他组分,6mL/kg·d）组。连续给药24d后,按照常规方法检测各组大鼠外周血红细胞（RBC）计数、血红蛋白（Hb）含量、红细胞压积（Hct）和血清中血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、EPO、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量以及红细胞脆性。采用HE染色的方法观察肾脏组织病理形态,采用实时定量PCR的方法检测肾皮质EPO和骨髓有核细胞（BMNC）中EPO受体（EPOR）的mRNA水平。结果显示,中、高剂量FEJ均可以显著升高外周血RBC、Hb、Hct水平,显著降低BUN、cr含量,显著升高血清SOD、GSH和GSH-Px的含量（P<0.05）,同时有升高血清EPO含量的趋势。低、中、高剂量FEJ都可以显著降低红细胞溶解率（P<0.05）。中、高剂量FEJ能够明显改善肾脏组织病理状态,同时显著上调肾皮质EPO和BMNC中EPOR mRNA水平（P<0.05）。此外,阿胶能够显著升高模型大鼠血清中SOD.GSH-Px的含量和骨髓有核细胞EPOR mRNA水平,WEFF能够显著升高GSH含量,显著降低红细胞溶解率（P<0.05）。这些结果表明,FEJ能够在整体上有效治疗肾性贫血大鼠。它是通过多因素、多途径、多靶点的综合性的整体效应来发挥治疗作用的,同时在这个过程中,FEJ中阿胶组分和WEFF组分具有互补作用。FEJ治疗肾性贫血可能的作用机制是：①增强体内自由基清除系统的功能,清除多余自由基；延缓肾脏病变的进程,减轻肾脏损伤程度；降低红细胞脆性,延长红细胞寿命；②上调肾皮质EPO mRNA和BMNC中EPOR mRNA的水平,同时可能促进了体内EPO的表达,增强骨髓红系造血功能。这两个因素又相互联系、相辅相成,从而形成了一个良性循环,最终在整体上改善肾性贫血。2FEJ对缺铁性贫血大鼠的治疗作用及作用机制采用低铁饲料喂饲并辅以少量放血的方法建立缺铁性贫血大鼠模型。建模成功后,所有动物随机分为11组：空白对照组,模型对照组,FEJ （5mL/kg-d）组,FeSO4（10mg/kg-d铁元素）组,低、中、高剂量FEJ（2.5、5、10mL/kg·d）与铁剂联合给药组,阿胶（250mg/kg·d）组,阿胶与铁剂联合给药组,WEFF（5mL/kg·d）组,WEFF与铁剂联合给药组。连续给药21d后,采用原子吸收分光光度法检测FEJ、50mg/mL阿胶溶液、WEFF中的铁含量；采用常规方法检测各组大鼠外周血RBC计数、Hb含量、Hct,及其心脏、脾脏、肝脏系数；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组大鼠血清铁（SI）、血清铁蛋白（SF）、血清转铁蛋白（sTRF）、血清转铁蛋白受体（sTfR）、血清EPO含量；采用RT-PCR的方法检测各组大鼠十二指肠中二价金属转运体-1（DMT-1）、金属转运蛋白-1（MTP-1）、亚铁氧化酶（Hp） mRNA的水平和肝脏中hepcidin mRNA的水平。结果显示, FEJ、50mg/mL阿胶溶液、WEFF中的铁含量分别为：108.871μg/ml、0.496μg/ml、46.115μg/ml。FEJ、FeSO4、3种剂量FEJ与铁剂联合给药均能够显著升高模型大鼠外周血中RBC计数、Hb和Hct水平；显著降低其心脏系数和脾脏系数,升高肝脏系数（P<0.05）；显著升高SI含量,降低sTRF、sTfR含量（P<0.05）。其中,FEJ与铁剂联合给药对模型大鼠的治疗效果最好,铁剂的治疗效果又优于FEJ, FEJ的治疗效果比单用阿胶和单用WEFF都要好。在3种不同剂量FEJ与铁剂联合用药组中,随着FEJ剂量的增加,SI含量有升高的趋势,SF含量有降低的趋势。在高剂量FEJ与铁剂联合给药组和WEFF组两组中,其十二指肠中DMT-1、MTP-1、Hp mRNA水平明显高于其他给药组。这些结果表明,FEJ能够在一定程度上改善缺铁性贫血,但不如铁剂治疗效果好,且在治疗缺铁性贫血时与铁剂联用可能具有协同作用。FEJ治疗缺铁性贫血的作用很大程度上可能是通过促进铁的吸收和利用（生成血红蛋白）来实现的,同时在这个过程中,FEJ中阿胶组分和WEFF组分具有互补作用。其具体的机制可能是FEJ除了能提供极少量的铁元素之外,还可以上调十二指肠中与铁转运相关的DMT-1、MTP-1、Hp这3种基因mRNA的水平,促进缺铁性贫血动物在十二指肠部位对铁的吸收；同时能够降低铁蛋白（储存铁）含量,且提高SI和sTRF的含量,进而增加进入骨髓中原始红系细胞的铁的量,最终促进血红蛋白的合成及红细胞的生成。3FEJ对骨髓抑制贫血小鼠的治疗作用及作用机制采用照射⁶⁰Co_γ射线、腹腔注射环磷酰胺和氯霉素的方法制备骨髓抑制贫血模型。造模后,所有动物共分为7组,分别为：空白对照组,模型对照组,低、中、高剂量FEJ（5、10、20mL/kg·d）组,阿胶（500mg/kg·d）组,WEFF（10mL/kg·d）组。连续给药10d后,采用常规方法检测各组小鼠外周血RBC计数、白细胞（WBC）计数、血小板（PLT）计数、Hb含量、BMNC的数量和胸腺、脾脏系数;采用甲基纤维素培养基体外培养的方法对红系集落形成单位（CFU-E）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、粒-单核系祖细胞集落形成单位（CFU-GM）和成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）进行计数；采用流式细胞术检测BMNC中造血干细胞（HSC）的比例、BMNC细胞周期和凋亡情况；采用HE染色的方法观察股骨骨髓组织病理形态；采用ELISA的方法检测各组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-6（IL-6）、粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、EPO的含量；采用RT-PCR的方法检测脾脏中IL-1β、IL-3、IL-6mRNA的水平。此外,在体外用不同浓度的FEJ （2.5.5,10μL/mL）、阿胶（250μg/mL）、WEFF （5μL/mL）处理培养的骨髓基质细胞（BMSC）48h后,用ELISA的方法检测培养上清液中GM-CSF、IL-6、干细胞因子（SCF）的含量,用RT-PCR的方法检测BMSC中GM-CSF、IL-6、SCF mRNA的水平。结果显示,中、高剂量FEJ能够显著升高模型小鼠外周血中WBC计数、RBC计数、Hb含量及BMNC的数量；显著增加贫血小鼠的体重和胸腺、脾脏系数；显著增加CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CUF-F集落的计数（P<0.05）,显著改善骨髓组织病理状态。高剂量FEJ能够显著提高模型小鼠BMNC中HSC的比例,增加进入S期、Gz／M期的骨髓细胞的比例,抑制BMNC中晚期凋亡细胞和总凋亡细胞的比例（P<0.05）。中、高剂量FEJ能够显著升高模型小鼠血清中GM-CSF、IL-3含量和脾脏中IL-1β、IL-3mRNA水平（P<0.05）；高剂量FEJ还能够显著降低血清中TGF-p含量（P<0.05）。在体外实验中,中、高剂量FEJ能够在体外显著增加BMSC分泌SCF、GM-CSF的量和BMSC中SCF、GM-CSF mRNA水平（P<0.05）；高剂量FEJ还能够显著增加BMSC分泌IL-6的量和BMSC中IL-6mRNA水平（P<0.05）。此外,阿胶对血常规、BMNC数量、造血祖细胞和CFU-F的计数、血清中造血相关细胞因子含量以及在体外对BMSC表达造血相关细胞因子等指标的改善情况与中剂量FEJ非常接近,但效果不如中剂量FEJ。在WEFF组中,BMNC的增殖指数显著升高（P<0.05）。这些结果表明,FEJ对于骨髓抑制贫血小鼠具有较好的治疗作用,在整体水平上明显改善了骨髓抑制的状态,增强骨髓的造血功能,同时在这个过程中,FEJ中阿胶组分和WEFF组分具有互补作用。FEJ促进模型小鼠造血功能恢复可能的作用机制主要有如下3种：①增强CFU-F的形成能力、改善骨髓病理状态以改善骨髓造血微环境；②促进BMNC的增殪,抑制BMNC的凋亡；③促进机体造血生长因子（IL-1β、IL-3、IL-6、SCF和GM-CSF）的表达,减少造血抑制因子（TGF-p）的表达。此外,这3种途径又相互联系、相互促进、相辅相成,最终在整体上改善了骨髓抑制贫血。