前言脑缺血再灌注损伤有着极其复杂的病理生理机制,其中涉及炎症反应,自由基损伤,兴奋性氨基酸生成,钙超载,细胞凋亡以及神经元代谢障碍等因素。最近大量研究表明急性炎症反应在缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)中起着关键作用,而且抑制炎症可以有效地缓解脑缺血再灌注导致的损伤。TLR4作为脂多糖(革兰氏阴性菌的细胞外壁的主要组成成分)的受体在先天免疫中所起的作用最重要。除了脂多糖,其他内源性的配体也可以激活TLR4受体,例如高速迁移族蛋白B1 (high-mobility group box 1, HMGB1),热休克蛋白60 (heat-shock protein 60, HSP60)等这些从坏死细胞中或者损伤细胞中释放的因子都可以激活TLR4激活NF-κB导致炎性因子TNF-a, IL-1p和IL-6的释放。另外,TLR4在神经系统中的表达并不仅仅局限于胶质细胞,最近的研究发现TLR4表达于皮质神经元中,而且在葡萄糖剥夺导致的能量代谢障碍中,神经元中的TLR4被激活表达量升高,使神经元更易于遭受缺血导致神经元死亡。TLR4的激活导致细胞内含有TIR结构域的接头蛋白例如MyD88和TRIF (TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon-β)聚集到TLR4的胞内结构域。因而TLR4介导的信号通路可以分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性／TRIF依赖型。MyD88最初是作为12个髓样分化初次应答基因中的成员被发现的,MyD88作为胞内接头蛋白能够介导10个TLRs家族的信号传导。研究表明接头蛋白MyD88基因敲除的小鼠能在肾脏和心肌的缺血再灌注损伤中能够大大减轻功能紊乱和组织的损伤。因此MyD88依赖性的信号通路可能参与了缺血再灌注导致的损伤,并在此过程中加重了器官损伤。然而在TLR4激活导致的肝脏的缺血再灌注损伤的研究中发现,TLR4介导的信号通路参与缺血再灌注损伤是通过IRF-3而不是通过MyD88依赖性的信号通路完成的。因此TLR4介导的MyD88信号通路在缺血再关准损伤中的作用,还有待于进一步研究。在本实验中,我们构建体外缺血模型,将PC12细胞用于氧糖剥夺处理,研究TLR4介导的MyD88信号通路在该过程中的作用。应用RNAi抑制MyD88的表达,研究阻断MyD88依赖性的信号通路后对炎症因子TNF-a, IL-1β的表达,细胞活力,以及氧糖剥夺下的细胞凋亡的影响。材料和方法一、实验材料(一)试剂和材料山羊抗大鼠TLR4多抗,兔抗大鼠MyD88多抗,小鼠抗大鼠β-actin单抗购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA)；辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊,山羊抗兔,兔抗小鼠等二抗均购自北京中山公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO),烟酸己可碱(Hoechst33342),碘化丙啶(propidium iodide, PI)等购自Sigma; RPMI1640,胎牛血清和马血清购自Gibco (Gibco, USA); BCA试剂盒购自碧云天生物技术公司。Polybrene,慢病毒载体和Enhanced Infection Solution购自上海吉凯基因化学技术有限公司。(二)主要仪器二氧化碳培养箱；超净工作台；电热恒温干燥箱；电子分析天平；恒温水浴箱；低温冷冻离心机；ABI7500实时定量PCR仪；PCR仪；紫外分光光度计；酶标仪；通用电泳仪；转印仪；正置荧光显微镜；倒置荧光显微镜；-80℃低温冰箱；液氮罐；凝胶成像仪。二、实验方法(一)PC12细胞培养和氧糖剥夺模型的建立。(二) Western blot检测TLR4和MyD88在氧糖剥夺各组的表达量变化。(三)PC12细胞慢病毒转染和RNA干扰沉默MyD88。(四)Reverse Transcriptase PCR检测TLR4在PC12细胞中的表达,Real-TimePCR检测IL-1β和TNF-a mRNA的表达量变化。(五)ELISA测定IL-1β和TNF-α的蛋白表达量变化。(六)Hoechst 33342/PI双染检测PC12细胞的凋亡和坏死。(七)MTT检测PC12细胞氧糖剥夺后的细胞活力。(八)数据分析。Western blot和RT-PCR结果采用Gel Pro Analyzer 4.0软件定量分析条带的IDV。ELISA结果采用origin 6.0制作标准曲线和计算样品数值。(九)数据统计。所有结果都表示为均数±标准差,在SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析,P<0.05和P<0.01为有统计学意义。实验结果一、TLR4在氧糖剥夺后的PC12细胞中的表达量上升应用RT-PCR和western blot证明TLR4表达于PC12细胞系。而且在PC12细胞氧糖剥夺时,TLR4的(?)mRNA和蛋白的表达量都升高。TLR4蛋白在氧糖剥夺2h组开始升高,在氧糖剥夺3h组达到最高,此时的表达量大约是对照组的3.5倍(p<0.01)。然后在氧糖剥夺4小时开始下降,到5h达到最低,大约相当于2h氧糖剥夺的水平但是与对照组相比还是明显的升高了(p<0.01)。TLR4 mRNA的表达量的变化基本上于蛋白的表达量的变化趋势相一致,TLR4 mRNA表达量的峰值出现在氧糖剥夺3h组,大约是对照组的3倍(p<0.01)。二、在氧糖剥夺处理的PC12细胞MyD88蛋白的表达量上升MyD88表达量随氧糖剥夺时间的变化情况。Western blot证明氧糖剥夺3h后,MyD88的表达量明显升高(p<0.01),到氧糖剥夺4h MyD88的表达量与对照组相比都明显升高(p<0.01)。然而经过5h的氧糖剥夺MyD88的表达量与对照组相比没有明显差异。MyD88的表达量在氧糖剥夺3h组达到最高,大约是对照组的3倍p<0.01),而在氧糖剥夺4h组,MyD88的表达量降至对照组的2倍左右(p<0.01)。三、慢病毒介导的PC12细胞中MyD88的沉默带有EGFP标记和针对MyD88的三个靶序列的慢病毒载体,以及阴性对照病毒转染到PC12细胞中。经过Real-time PCR筛选沉默效率最高的序列为靶三5’-CATACGCAACCAGCAGAAA-3’),经过western blot检测,该序列对MyD88蛋白的表达与对照组相比下调80±11%(P<0.01)。四、氧糖剥夺诱导IL-1β和TNF-α的表达需要MyD88依赖性的信号通路Western blot和RT-PCR实验结果证明氧糖剥夺3h后TLR4和MyD88表达量达到最高,因此对IL-1β和TNF-α的检测我们选在氧糖剥夺3h组。氧糖剥夺3h后OGD组细胞培养上清中TNF-α的mRNA和蛋白与对照组相比都有显著升高。Real-Time PCR和ELISA证明,RNA干扰沉默MyD88后TNF-α的表达量与OGD组和NC组相比表达量有所下降(p<0.01)。另外Real-Time PCR证明IL-1β的(?)nRNA在OGD组PC12中明显升高,而阻断MyD88依赖性的信号通路之后,RNAi组的IL-1β表达量与OGD组和NC组相比明显下降(p<0.01)。五、阻断MyD88依赖性的信号通路提高PC12细胞在氧糖剥夺后的存活率MTT结果显示,3h的氧糖剥夺和24h的复氧之后,设对照组细胞活力为100%,OGD组的细胞活力低到52.79±5.76%,而NC组的细胞活力降低到49.97±3.45%,而且这两组之间相比无统计学差异。但是RNAi组氧糖剥夺之后的细胞活力降低到65.12±1.55%,与OGD组和NC组相比有明显的升高(p<0.01)。Hoechst33342/PI染色的结果显示,3h氧糖剥夺之后几乎没有明显的细胞坏死出现。设对照组细胞凋亡数量为0,RNAi组的凋亡细胞的数量为12.7±0.8%,而OGD组和NC组的细胞凋亡数量分别为24.7±6.42%和26.2±5.7%(P<0.05 RNAi vs. control and P<0.01 RNAi vs. NC, n=3)讨论实验表明在氧糖剥夺处理的PC12细胞中,TLR4和MyD88的表达量上调,表明TLR4和MyD88在氧糖剥夺的PC12中被激活。而且TLR4的表达是呈时间依赖性的形式变化。同时MyD88作为TLR4的下游接头蛋白,其表达量在氧糖剥夺3-4h之后,也有明显的升高。与TLR4表达趋势相同在氧糖剥夺三小时,MyD88的表达量达到最高,之后开始下降,这表明在氧糖剥夺过程中对TLR4介导的MyD88信号通路存在调控机制。MyD88作为TLRs家族的胞内接头蛋白,最终导致转录因子NF-κB的活化,最终导致炎症因子IL-1p, TNF-a和IL-6转录表达。这些炎症因子的表达,使器官内的炎症反应恶化,导致细胞损伤和凋亡。有报道称,内源性的TNF-α加重局灶性的缺血损伤,在脑梗塞中阻断TNF-α能够减轻脑缺血损伤。在我们的研究中我们发现,氧糖剥夺处理PC12细胞,在细胞培养上清中IL-1β和TNF-α的水平上升,而用RNA干扰阻断MyD88信号通路之后,经过氧糖剥夺,PC12细胞培养上清的IL-1β和TNF-α表达量明显下降。TLR4介导的信号通路在能量剥夺处理的皮质神经元中激活,并且导致JNK-AP1信号通路和Caspase-3的激活,在我们的研究中发现,RNA沉默MyD88组的细胞经过3h氧糖剥夺之后,细胞活力明显强于氧糖剥夺组和阴性病毒转染组。并且,MyD88沉默组的凋亡细胞的数量与氧糖剥夺组和阴性病毒转染组相比呈现明显的下降。这可能是由于阻断MyD88依赖性的信号通路之后,也阻断了JNK-AP1的活化,并且减少了TNF-α等细胞因子的表达。因此,TLR4介导的MyD88信号通路在氧糖剥夺导致的细胞损伤中起着重要的作用。结论1、本研究首次证明,TLR4表达于PC12细胞中,在PC12细胞的氧糖剥夺中TLR4被激活。2、TLR4的细胞内接头蛋白MyD88在PC12细胞的氧糖剥夺中被激活。3、RNA干扰沉默MyD88,炎症因子IL-1β和TNF-α的表达量下调,PC12细胞在氧糖剥夺之后细胞活力与氧糖剥夺组相比提高,凋亡的细胞数目减少。