原生质体融合也称为体细胞杂交或细胞融合,是通过人工方法使具有不同遗传性状的两个细胞的原生质体发生融合,并产生单核或多核融合子的过程,是“细胞工程,,的重要内容。原生质体融合技术分诱导融合和自发融合,前者是指分离原生质体后,通过加入诱导剂或使用其他方法诱导使不同亲本原生质体发生融合的过程;后者是指细胞或植物组织在用酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象。体细胞杂交可在种内、种间、属间、科间甚至是界间的任何原生质体问进行,它不仅可以突破物种间的生殖隔离,创造远缘杂种;同时还可以使双亲的细胞质基因结合在一起,从而达到改良更多性状的目的。　　 为避开有性融合的局限性,本文利用酵母原生质体无性融合的方法,研究同种接合型酵母菌株无性融合的条件及特点,首先利用质粒构建了酵母双杂交工程菌株Y2HGold的亮氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型菌株,接着采用酶解法进行四因素三水平正交实验获得原生质体制备方案,最后采用PEG诱导融合的方法,经过同样正交实验得到优化后的Y2HGold无性融合条件,筛选得到遗传上稳定的无性融合子。这为进一步探索同种接合型酵母菌无性融合的潜在应用价值提供了依据。主要研究结果总结如下:　　 (1)遗传标记　　 本实验根据酵母双杂交工程菌株Y2HGold基因结构特点,成功构建了亮氨酸、色氨酸缺陷型菌株。　　 (2)融合影响因素　　 单因素试验及正交实验结果表明,酶解温度、酶处理时间、酶浓度和预处理剂这四个与制备原生质体相关的关键因素对原生质体的制备和再生都有影响,其中酶解温度和酶处理时间对再生率和制备率的影响差异达到极显著水平(P＜0.01),混合酶对原生质体再生率的影响差异达到显著水平,而预处理剂对原生质体再生率的影响差异不显著;无性融合四个主要因素对融合率的影响差异都具有极显著性意义。　　 (3)原生质体的制备和融合方案　　 Y2HGold原生质体最佳制备方案:酶解温度30℃,处理时间80min、预处理剂含0.1%(w/v)巯基乙醇和0.1%(w/v)EDTA-2Na,酶解液为1.5%(w/v)蜗牛酶和1.5%(w/v)纤维素酶;Y2HGold无性融合最佳条件为:PEG浓度35%、温度25℃、时间40min、pH5.8,融合率达12.6×10-6。　　 (4)无性融合与有性融合的区别　　 从融合菌株的显微结构上看得到无性融合子“三叶草”结构图中的子细胞较有性融合子的子细胞普遍偏大、母细胞偏小,而有性融合子的子细胞与母细胞大小相当,这说明在融合子形态上表现为无性融合比有性融合可能更为彻底;在时间上无性融合可以在短短的40min内融合,有性融合则需要20～24h,但在培养过程中无性融合子在SD/2培养基上生长缓慢、周期偏长,这说明aa和aa跟aa相比具有生长劣势。