研究背景腰椎间盘退变和突出是目前临床上引起下腰痛的主要病因。各种腰椎间盘切除手术由于解除了椎间盘组织对马尾神经和神经根的压迫,短期内具有良好的临床效果。但由于术后椎间盘承重作用的破坏,产生了一系列生物力学紊乱,晚期不可避免的出现关节突关节增生、椎管狭窄和腰椎不稳定,引起相应的症状。脊柱融合术虽能完全切除退变椎间盘组织,稳定病变节段,但由于融合后应力转移集中至相邻节段,又会开始加速邻近椎间盘退变过程,导致恶性循环。此外,脊柱融合术还会带来髂骨等供骨区疼痛、植骨块不融合、假关节形成以及内固定断裂等并发症。腰椎人工髓核置换术由于在治疗腰椎退行性病变的同时保留了脊柱的运动功能,理论上可以克服单纯腰椎间盘摘除术和腰椎融合术的缺点。近年来,国内外学者进行了深入的研究,随访结果报告这种方法的短期临床疗效较好,但随着随访时间的延长,部分患者出现软骨终板损伤及假体下沉。有学者认为此种并发症可能与髓核假体弹性模量过高有关。为寻求更理想的髓核材料,本课题组研制了一种新型人工髓核材料---果胶/聚乙烯醇复合(Pectin/ PVA composite, CoPP)水凝胶。通过对该材料的力学性能、溶涨性能等相关基础研究发现果胶/聚乙烯醇复合水凝胶是一种软而韧、缓冲载荷能力较强、渗透性好的粘弹性材料,力学特性更接近人体正常髓核,弹性模量约为2.8Mpa,有望成为理想的人工髓核材料。为进一步探讨果胶/聚乙烯醇复合水凝胶作为人工髓核材料应用的价值,本课题在对果胶/聚乙烯醇复合水凝胶作为人工髓核假体的基础研究之上,继续完善其生物组织相容性；将果胶/聚乙烯醇复合水凝胶铸成正常髓核外形的假体,植入新鲜人体腰椎标本评价其生物力学性能；最后建立兔腰椎髓核置换手术的动物模型,并比较果胶/聚乙烯醇复合水凝胶和聚乙烯醇水凝胶作为髓核假体对阻抑椎间盘退变的作用。研究目的1.评价果胶/聚乙烯醇复合水凝胶作为新型人工髓核材料的生物组织相容性。2.评价果胶/聚乙烯醇复合水凝胶人工髓核植入对腰椎稳定性的影响；并与腰椎前路融合比较,评价对邻近节段运动范围和椎间盘内压的影响。3.建立动物模型,评价果胶/聚乙烯醇复合水凝胶人工髓核置换延缓腰椎间盘退变的治疗作用。研究方法1.按照国家标准G B/T 1 6 8 8 6的要求,对果胶/聚乙烯醇复合水凝胶进行了全身急性毒性试验、致敏试验、溶血试验、A m e s试验、小鼠骨髓细胞微核试验和哺乳细胞体外染色体畸变试验等基本评价试验的毒理学测试。2.采用6具新鲜人体腰椎标本(L3-L5)进行生物力学实验。经过肉眼观察和X线摄片排除明显退变、畸形等异常。剔除周围附着的肌肉,保留腰椎韧带、椎间盘、关节囊和附件等结构的完整性。将标本固定在机器人脊柱测试系统上,通过位移加载控制的方式加载,设置最大位移值是前屈20°,余运动方向为15°。加载的速度是1°/秒。以L4/5椎间盘为手术椎间盘,在前屈后伸、左右侧屈及左右轴向旋转等不同运动方向下,观察正常椎间盘、CoPP人工髓核置换和腰椎前路cage植入三种状态下L4/5和L3/4的运动范围以及L3/4椎间盘内压的变化情况。在测试过程中每10分钟向测试标本喷洒生理盐水,保证标本的湿度。每种状态重复加载三次,消除标本的粘弹性,记录第三次的数据用来分析结果。在中立位轴向加载前后比较正常椎间盘组、髓核摘除组与CoPP人工髓核植入组三种不同状态下椎间隙高度变化。通过分组比较分析,评价CoPP人工髓核的生物力学特征。3.取48只成年新西兰大白兔,建立腰椎髓核置换的动物模型,从左前外侧经腹膜外显露L3/4, L4/5两个椎间盘,可接受四种不同的处理：A：只显露不作其他处理(假手术椎间盘组)；B：针刺损伤(穿刺椎间盘组)；C：聚乙烯醇水凝胶植入(PVA椎间盘组)；D：果胶/聚乙烯醇水凝胶植入(CoPP椎间盘组)。其中一椎间盘接受A、B组中的一个处理方式,另一椎间盘则接受C、D组中的一个处理方式,一共得到四种组合结果(即A+C、A+D、B+C、B+D),48只大白兔按随机数字表分组,每种组合组各占12只。由此,全部实验椎间盘分成假手术组、穿刺组、PVA组和CoPP组。于术前、术后1、3、6个月摄腰椎侧位X线片,测量椎间盘高度指数,计算术后不同时间实验椎间盘的椎间盘高度指数百分比。同时,对实验椎间盘进行病理组织学评估,以椎间盘纤维环退变分级的定量分析方法比较各组椎间盘在不同时间点的治疗效果。此外,观察CoPP和PVA假体在椎间盘有无移位、下沉及与周围组织的关系。结果1. (1)全身急性毒性试验：注射72h后,与注射前相比,阴性对照组、CoPP组小鼠体重均呈增长趋势。此两组小鼠均无腹泻、抽搐等异常行为,无死亡现象。阳性对照组小鼠注射苯酚后出现抽搐,不久后便全部死亡。热原试验表明CoPP材料浸提液初试3只家兔体温升高分别为0.3、0、-0.1℃,3只家兔体温升高总度数为0.2℃,说明CoPP材料没有全身急性毒性和热原性。(2)致敏试验：注射CoPP材料浸提液的豚鼠在除去帖敷物后24、48和72h观察期间,无红斑及水肿等皮肤刺激反应,结果同注射生理盐水的阴性对照组,反应分级为0级。(3)溶血试验：CoPP材料浸提液的溶血率为1.24%,满足生物材料临床应用的要求(小于5%)。(4)遗传毒性试验：CoPP人工髓核材料浸提液各剂量组对TA97、TA98、TA100、TA102的回变菌落数,在加与不加大鼠肝微粒体酶(S9)条件下,均与自发回变数相近,也未呈现剂量反应关系；CoPP髓核材料浸提液各剂量组中微核出现率与阳性对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01),而与阴性组相比,差异无显著性意义(P>0.05);CoPP髓核材料浸提液的各剂量组,无论加或不加大鼠肝微粒体(S9),染色体畸变率与阴性对照组相比差异无显著性(P>0.05),且各剂量组畸变率均小于5%,说明CoPP材料没有遗传毒性。2.(1)三维运动范围方面：在L4/5手术节段,CoPP组与完整椎间盘组的运动范围除左侧屈运动方向差异有显著性外(P<0.05),余其他方向,L4/5运动范围两者之间差异均无显著性(P>0.05),CoPP人工髓核植入后,相对于完整椎间盘,运动范围无明显改变。而cage组与完整椎间盘组或CoPP组之间,在所有的运动方向,L4/5运动范围的差异均有显著性(P<0.05), L4/5运动范围明显减少。而在相邻上节段L3/4, CoPP组与完整椎间盘组的运动范围除左侧屈运动方向差异有显著性外(P<0.05),余其他方向,L3/4运动范围两者之间差异均无显著性(P>0.05)。而cage组与完整椎间盘组或CoPP组之间,在所有的运动方向,L3/4运动范围的差异均有显著性(P<0.05), L3/4运动范围相对其他两组明显增加。(2)L3/4椎间盘内压：CoPP组与完整椎间盘组在所有的运动方向两者之间的差异无显著性(P>0.05), CoPP人工髓核植入后对相邻上节段椎间盘内压影响不明显。而cage组与完整椎间盘组或CoPP组在前屈后伸及左右侧屈运动方向两者之间差异有显著性(P<0.05), cage植入后相邻上节段椎间盘内压增加明显,而在轴向旋转方向,两者之间差异无显著性(P>0.05)。(3)椎间盘前缘高度：髓核摘除后,在无载荷条件下,椎间盘高度相对完整状态下降12.5%；而在500N载荷下,椎间盘高度相对完整状态下降15.7%,加载前后两者之间差异均有显著性(P<0.05)。但植入CoPP人工髓核后,无载荷条件下,椎间盘高度相对完整状态升高0.87%,在500N载荷下,椎间盘高度相对完整状态升高6.6%,加载前后完整组与CoPP组两者之间差异没有显著性(P>0.05),加载前后较髓核摘除组分别升高13.3％、24.5％,加载前后两者之间差异有显著性(P<0.05)。说明植入CoPP人工髓核后可维持髓核摘除后椎间隙的高度。3.(1)手术选用左侧腹膜外入路,手术顺利,兔腰椎侧方显示良好,可很好地显露L2-6椎体与椎间盘左前大部分。术中出血较少,未发生腹膜破裂,手术损伤小。本实验中48只兔有3只兔死亡,1只兔因麻醉过量致死；1只术后3天死亡,考虑为术中止血不彻底所致；1只因造模过程针刺损伤右侧腰神经致右下肢瘫痪,术后3周继发泌尿系感染死亡。余下45只兔无伤口感染或其他手术并发症发生,在观察期内全部存活实验动物均存活。(2)大体标本上未发现CoPP或PVA植入物移位的现象,如预期手术效果那样,植入物两端均突出于椎间盘小许。CoPP或PVA植入物在3个月后能牢牢地固定在植入部位而不易从椎间盘拖出。CoPP或PVA植入物周围与假手术椎间盘相似,无明显颜色异常及炎症反应。而穿刺椎间盘相邻椎体在术后3月可见部分骨赘形成。(3)影像学结果(％DHI):随术后时间的延长,手术后各时间点椎间隙高度指数百分比呈现逐渐下降趋势。假手术组在术后1、3、6个月各时间点分别是(90.6±1.13)％、(90.1±0.37)％、(81.7±20.3)％；穿刺椎间盘分别为(69.3±5.8)％、(63.4±0.81)％、(55.1±7.1)％、PVA椎间盘分别(93.3±2.6)％、(89.9±0.14)％、(76.6±4.8)％；CoPP椎间盘分别为(94.7±2.6)%、(91.3±1.9)％、(77.6±19.3)％。在各时间点的椎间隙高度指数百分比,CoPP组、PVA组与假手术组三者之间差异无显著性(P>0.05),但均与穿刺组差异有显著性(P<0.05)。(4)组织病理学结果：CoPP或PVA试件在术后一个月与椎间盘组织有少许裂隙,但随术后观察时间的延长,裂隙逐渐变小不清晰,上下终板与PVA/CoPP试件紧密接触,所有植入物在头尾方向出现轻度的压扁并接触终板。在术后6个月,PVA试件有3例下沉到终板,而CoPP有1例下沉到终板。随着术后观察时间的延长,椎间盘纤维环紊乱逐渐明显且向外层纤维环扩散。CoPP或PVA椎间盘在术后1个月纤维层的紊乱仅限于内1/3,但逐渐扩展到中2/3。穿刺椎间盘组在术后退变最明显,髓核组织明显的减少并被密集的纤维软骨组织替代,纤维环紊乱扩展到外层,有时纤维环出现翻转。纤维环退变分级在术后1、3个月CoPP组、PVA组与假手术组三者之间差异无显著性(P>0.05),均与穿刺组差异有显著性(P<0.05)；但术后6个月,CoPP组和PVA组与假手术组之间差异也有显著性(P<0.05),亦与穿刺组差异有显著性(P<0.05)。结论1.CoPP水凝胶人工髓核材料无细胞毒性、无溶血性、对皮肤无潜在致敏作用、无致突变作用,说明该材料生物相容性良好,可进入临床使用。2.CoPP人工髓核植入能保留手术节段的运动功能,稳定脊柱与维持椎间盘的高度。相对腰椎融合手术,CoPP对相邻节段运动范围和椎间盘内压无明显影响,从而可降低或避免相邻节段退变的发生率。3.果胶/聚乙烯醇复合水凝胶人工髓核置换术可保留椎间盘高度和填充髓核空间,延缓纤维环的退变。合适的髓核假体外形与微创植入技术是获得良好远期疗效的保证。