【摘 要】
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研究目的:通过评估人排卵前卵泡中卵丘细胞（cumulus cell,CC）与壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）在形态学,转录组学,蛋白组学以及代谢组学等多方面的差异,从CC及MGC角度进一步探讨卵母细胞成熟机制。研究材料及方法:收集2020年3月到2021年5月份在同济大学附属第十人民医院生殖医学中心接受体外受精/胞浆内精子注射治疗的177例不孕女性卵泡液中的CC和MG
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研究目的:通过评估人排卵前卵泡中卵丘细胞（cumulus cell,CC）与壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）在形态学,转录组学,蛋白组学以及代谢组学等多方面的差异,从CC及MGC角度进一步探讨卵母细胞成熟机制。研究材料及方法:收集2020年3月到2021年5月份在同济大学附属第十人民医院生殖医学中心接受体外受精/胞浆内精子注射治疗的177例不孕女性卵泡液中的CC和MGC,根据密度梯度离心原理,采用Percoll方案分离纯化CC和MGC作为本研究的研究材料。检测方案及指标:1.分别通过光学显微镜、免疫荧光检测以及透射电镜检测观察CC和MGC在形态上的差异。2.通过人细胞非靶代谢组学分析（色谱-质谱分析）评估CC和MGC的代谢组学差异;分析CC与MGC代谢组学上的差异,选择显著差异性代谢产物,分析其相关的代谢通路。3.通过定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,q PCR）评估CC和MGC中相关的基因表达水平。4.通过蛋白质印迹分析,评估CC和MGC中相关的蛋白表达水平。5.收集CC与MGC体外培养48小时的分泌培养基,根据电化学发光免疫分析法,使用孕酮检测试剂盒和雌二醇检测试剂盒测定孕酮和雌二醇（estradiol,E2）水平,Cobas 6000罗氏全自动电化学发光仪测定孕酮和E2值。结果:1.CC与MGC之间存在微小的形态差异。体式显微镜下排卵前卵泡中的CC胞质疏松、透明似云状,MGC胞质暗沉、致密呈片状。免疫荧光检测显示单层生长的MGC形态呈梭形、圆形或不规则,CC形态多为圆形。透射电镜下CC和MGC的细胞器超微结构呈高代谢及丰富甾体合成表现,排卵前未培养MGC的超微结构已出现黄体化特征,CC胞膜上观察到正在胞吞或胞吐的脂滴。培养后CC出现黄体化且特征更显著,滑面内质网（smooth endoplasmic reticulum,SER）在线粒体和脂滴周围广泛分布,MGC中高尔基体更丰富,大量粗面内质网（rough endoplasmic reticulum,RER）平行堆叠。2.代谢分析结果表明,CC和MGC之间有101种代谢物存在显著差异,其中7种代谢产物在CC中富集,94种代谢产物在MGC中富集。与胆固醇运输和E2生成相关的代谢产物胆固醇硫酸酯（cholesteryl sulfate,CS）在CC中富集,与抗细胞凋亡相关的代谢物Thioetheramide-PC和1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰甘油（1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol,POPG）在MGC中富集。3.q PCR及蛋白印迹检测结果显示,在CC中,参与CS代谢途径中物质转运（ABCA1、LDLR和SCARB1）及E2生成（SULT2B1和CYP19A1）通路相关的基因和蛋白的表达显著升高;在MGC中,参与抗凋亡的基因和蛋白（CRLS1、LPCAT3和PLA2G4A）的表达显著升高。4.激素检测结果表明,CC中的E2水平明显高于MGC,而孕酮水平在CC和MGC中无显著差异。结论:1.CC和MGC之间存在形态学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等多方面的差异。2.与胆固醇运输和E2生成相关的代谢物,CS,在CC中富集;与抗细胞凋亡相关的代谢物,Thioetheramide-PC和POPG,在MGC中富集。3.CC和MGC在代谢组学方面的差异可能涉及到卵母细胞成熟相关机制的调节。
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