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猪乙型脑炎是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)经媒介蚊虫传播的一种人兽共患病。JEV可引起种猪的繁殖障碍,给我国养猪业造成巨大的经济损失。本研究通过猪乙型脑炎病毒一步法RT-PCR检测方法的研究为我国动物养殖事业提供了诊断技术支持和保障。研究主要内容如下：猪乙脑病毒RNA提取方法的研究：本研究分别用异硫氰酸胍法、Trizol试剂法和RNA抽提试剂盒法对乙型脑炎病毒RNA提取方法进行对比试验,再用紫外光分析所得RNA纯度、电泳验证RNA提取的完整性方法对三种提取方法进行评价,以找出适合猪乙型脑炎病毒RNA的提取方法。三种RNA提取方法的对比试验表明：三种方法中,异硫氰酸胍法提取的RNA样品纯度不高,且不完整；Trizol试剂法和RNA抽提试剂盒法提取的RNA样品纯度和完整性都较理想,两者提取效果差异不显著,考虑到成本的因素,可选用Trizol试剂法做为RNA提取方法；考虑方便可选择RNA提取试剂盒作为RNA提取方法。本试验用总RNA提取试剂盒提取病毒液RNA,用Trizol试剂法提取病料样品RNA。一步法RT-PCR检测方法的建立：以乙脑SA14-14-2毒株为参照确定扩增靶序列并设计合成一对引物,扩增长度为420bp,建立了一步法RT-PCR检测JEV的诊断方法,确定总反应程序为42℃30min,94℃3min,94℃30s57℃30s72℃40s30个循环,72℃5min；最终确定反应为50ul体系：taq酶0.5ul(2.0U),AMV反转录酶0.5ul(2.0),镁离子5ul (2.5mmol/L),超纯dNTP5ul, RT-PCR buffer5ul,上下游引物各lul, ddH,029ul。验证该方法的灵敏度能达到5pg,组内和组间重复性和稳定性试验显示该方法具有良好的重复性和稳定性；对乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等病毒进行扩增,结果显示该方法对JEV具有高度特异性。猪乙脑病毒一步法RT-PCR检测方法的初步应用：用本研究建立方法分别对JEV疫苗免疫小鼠、JEV人工感染小鼠和自然感染病例进行检测。结果表明：本方法对8份JEV疫苗免疫小鼠的检测结果全部呈阴性；本方法可以对人工感染小鼠进行早期检测；本方法对9份自然感染阳性病例的检测结果与JEV的分离鉴定结果一致。用一步法RT-PCR检测方法、国标两步法RT-PCR和ELISA方法对阳性样品和人工感染样品进行对比检测。结果表明：本方法和国标两步法RT-PCR均能特异地检测出JEV,本方法比两步法RT-PCR节约了成本,节省了约1.5h的检测时间,并降低了试剂污染的可能。本方法和ELISA方法均能特异地检测出JEV。试验结果表明：通过上述方法建立并优化后的猪乙型脑炎一步法RT-PCR检测方法具有特异、可靠、灵敏、方便、稳定、快捷等优点,适合于临床检测,为我国JEV检测提供了切实可行的技术手段。