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研究背景:冠状动脉硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)作为心血管病中发病率与死亡率均较高的心血管病之一,严重危害人们身体健康,而且这些年来其发病率在我国有显著增加的趋势,成为一个严重的社会问题。冠心病的发生发展过程受诸多因素影响,其中由于动脉粥样硬化(Atherosclerosis As)斑块形成造成的动脉血管壁增厚、硬化、钙化、斑块破裂、血栓形成,最终导致管腔狭窄甚至闭塞,是以冠心病为代表的动脉粥样硬化性疾病的发病基础。以经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention PCI)为代表的心血管介入技术给冠心病的临床治疗带来了革命性的变化,挽救了无数人的生命,成为心血管临床领域最有效的方法之一,但PCI术后再狭窄由于其发病率高,处理困难,因而严重影响了PCI的远期疗效,尽管随着介入技术的发展及新型药物洗脱支架的应用,PCI再狭窄率已有显著降低,但仍有3-10%的发生率。因此,如何防止再狭窄成为冠心病治疗领域的研究热点之一。Schwartz等研究表明,再狭窄的病理基础是新生内膜增生,而新生内膜形成过程中,由于血管损伤,血管结构破坏,使血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)由中膜层向内膜层迁移,并在包括血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)在内的多种因子作用下,发生表型变化,由收缩型转为分泌型,并分泌大量细胞因子、炎症因子,反过来又加速了VSMCs在局部的增殖以及炎症细胞浸润,导致新生内膜形成,从而最终导致支架内再狭窄。因此,迁移增殖的VSMCs的平滑肌细胞是增厚的新生内膜的主要组织学成分。而抑制VSMCs的迁移增殖也就成为防治再狭窄的一个重要靶点。AngⅡ是一多向作用因子,它与不同的受体亚型结合产生不同的生物学作用,血管紧张素Ⅱ1型受体(angⅡtype 1 receptor,AT1R)介导产生促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强血管收缩等作用,血管紧张素Ⅱ2型受体(angⅡtype 2 receptor,AT2R)却与之相拮抗。由于AT2R在成年动物体内表达较少或不表达,因此,在新生内膜形成过程中,AngⅡ主要通过AT1R作用导致和加速新生内膜的形成。如果某种方法能够增强AT2R的表达,则可通过其与AT1R相拮抗的作用来抵消AT1R的生物学效应,从而达到抑制血管新生内膜形成的目的。这是本课题立题的理论基础。研究目的:1.以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为基因转染示踪物,构建EGFP-AT2R融合蛋白的真核表达载体,转染体外培养的大鼠VSMCs。2.检测AT2R基因在大鼠VSMCs中的mRNA及蛋白表达水平,证实可通过真核表达载体成功转染VSMCs并获得较好表达率。3.检测AT2R高表达对VSMCs的增殖与凋亡的影响,证实AT2R在VSMCs的表达可明显抑制其增殖并促进其凋亡,从而为AT2R基因治疗血管再狭窄(restenosis, RS)的进一步研究奠定基础。研究方法:1.用组织块贴壁法原代培养大鼠胸主动脉VSMC;倒置显微镜行形态学观察并使用免疫荧光法检测α-SM-actin鉴定VSMCs。2.以pUHD-10.3/AT2R质粒为模板,PCR扩增AT2R基因的全长cDNA序列,再将其克隆入载体pEGFP-N2,构建其真核表达载体pEGFP-N2/AT2R。3.脂质体Lipofectamine2000对VSMCs进行AT2R转染;倒置荧光显微镜观测转染后VSMCs生长变化,用RT-PCR及Western blot检测AT2R在其中的表达情况。4.通过MTT试验,检测AT2R基因对大鼠VSMCs增殖能力影响, Western blot检测AT2R对VSMC的增殖细胞抗原(PCNA)的影响。5.流式细胞术检测AT2R基因对大鼠VSMCs促凋亡作用。研究结果:1.本实验利用组织块贴壁法成功地培养了大鼠VSMCs,并由形态学及免疫荧光细胞化学证实,为进一步实验提供了平台;2.pEGFP-N2/AT2R成功构建,经测序与NCBI基因库报道序列完全一致。3. AT2R转染VSMCs后,荧光显微镜下检测其阳性表达率大约在40%,经RT-PCR及Western blot证实重组真核表达载体pEGFP-N2/AT2R转染组的AT2R基因mRNA及蛋白表达水平高于未转染组及pEGFP-N2转染组。4.转染AT2R基因组MTT吸光度值(0.141±0.015),明显低于未转染组(0. 315±0.031)和pEGFP-N2转染组(0.295±0.023 ),而未转染组和pEGFP-N2转染组之间无差异;Western Blot发现pEGFP-N2/AT2R转染组PCNA蛋白的表达显著低于pEGFP-N2转染组及未转染组,表明AT2R高表达后能够下调PCNA蛋白表达,与MTT法检测细胞增殖结果一致。5.流式细胞术表明与未转染组和pEGFP-N2转染组比较,转染AT2R基因可以促进VSMCs早期凋亡。研究结论:1.真核表达载体pEGFP-N2/AT2R成功构建,并在VSMCs中稳定表达.2. AT2R基因与VSMCs增殖能力密切相关,AT2R过表达可显著下调PCNA蛋白表达,亦可明显抑制VSMCs增殖活性。3.流式细胞仪检测的细胞凋亡结果表明,AT2R转染表达后,体外培养的VSMCs凋亡明显增加,这一作用对抑制VSMCs增殖是有益的。