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【研究目的】
本课题通过构建小鼠抑郁模型，拟证实乳酸能够改善脂多糖(LPS)诱导小鼠抑郁样行为，初步探究乳酸发挥抗抑郁作用的分子机制。
【方法】
1.使用不同浓度(0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg)LPS构建小鼠抑郁模型，通过检测悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验及动物体重等指标，选择合适的造模浓度及判断动物模型是否符合实验要求。
2.探究外源性乳酸对LPS诱导的小鼠抑郁模型行为学功能的影响。将实验动物随机分为正常组、生理盐水组(Nacl组)、乳酸组(LA组)、脂多糖+生理盐水组(LPS+Nacl组)、脂多糖+乳酸组(LPS+LA组)检测抑郁行为学功能指标的变化。
3.检测小鼠抑郁模型海马在LPS处理后0h、1.5h、6h、12h、24h、30h、48h乳酸的变化。
探究外源性乳酸是否能够通过血脑屏障(BBB)。将实验动物随机分为正常组和LA组，检测小鼠海马在LPS处理0h、0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、48h后乳酸的变化。
为了进一步了解外源性乳酸对LPS诱导海马乳酸变化的影响。将实验动物随机分为正常组、LPS+Nacl组、LPS+LA组，检测LPS处理后0h、0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、30h、48h海马乳酸的变化。
4.通过酶联免疫吸附法检测LPS在不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h)对海马促炎性因子TNF-α及IL-1β表达的影响。
探究外源性乳酸对LPS诱导促炎性因子变化的影响。将实验动物随机分为正常组、LPS+Nacl组、LPS+LA组，检测在不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h)对海马TNF-α及IL-1β表达的影响。
5.初步探究外源性乳酸对LPS诱导的NF-κB通路及NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)蛋白表达的影响。
【结果】
1.探究构建LPS小鼠抑郁模型的合适浓度。结果显示0.5mg/kg、0.7mg/kg及0.8mg/kgLPS均能够诱导抑郁样行为。具体表现在：悬尾实验及强迫游泳实验不动时间显著增加(P＜0.01)、蔗糖消耗率明显降低(P＜0.01)及LPS处理后6h、12h、24h体重显著下降(P＜0.01)。
2.探究外源性乳酸对LPS诱导小鼠抑郁模型行为学功能的影响。结果显示与Control组相比，Nacl组和LA组在悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验及体重等指标中无显著性差异(P＞0.05)。LPS+LA组相较于LPS+Nacl组悬尾实验、强迫游泳实验中不动时间显著减少(P＜0.001)，糖水偏好实验蔗糖消耗率明显升高(P＜0.01)，但是对体重并没有影响。
3.检测LPS诱导小鼠抑郁模型海马乳酸的变化。结果显示LPS处理后24h及30h乳酸有明显下降的趋势(P＜0.05)。而正常组海马在外源性乳酸注射后0.5h、1h、2h、6h、12h乳酸水平显著升高(P＜0.05)。进一步探究外源性乳酸对LPS诱导海马乳酸的影响，实验结果显示与LPS+Nacl组相比，LPS+LA组海马乳酸在2h、6h、12h、24h、30h明显升高(P＜0.05)。
4.检测LPS诱导海马促炎性细胞因子TNF-α及IL-1β表达的影响。结果显示与Control组相比，LPS组TNF-α在LPS注射后2h显著升高(P＜0.01)，而IL-1β在1h、2h、6h显著升高且在6h达到峰值(P＜0.01)。
探究外源性乳酸对LPS诱导的海马TNF-α及IL-1β表达的影响。结果显示，LPS+LA组相较于LPS+Nacl组海马TNF-α表达水平在2h明显下降(P＜0.01)，而IL-1β在6h显著降低(P＜0.05)。
5.初步探究外源性乳酸对LPS诱导的NF-κB通路的影响。Westernblot实验结果显示，与Control组相比，LPS组小鼠海马P-NF-κB在6h、12h、24h蛋白表达显著上调(P＜0.01)，而NF-κB蛋白表达没有显著变化(P＞0.05)。外源性给予乳酸后在6h、12h、24h显著下调抑郁小鼠海马P-NF-κB蛋白表达水平(P＜0.05)。
初步探究外源性乳酸对LPS诱导的NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)蛋白表达的影响。Westernblot实验结果显示，与Control组相比，LPS组小鼠海马NLRP3、ASC、Caspase-1在6h、12h、24h蛋白表达显著上调(P＜0.05)。而Pro-Caspase-1(前体Caspase-1)蛋白表达没有显著变化(P＞0.05)。外源性给予乳酸后在6h、12h、24h显著下调抑郁小鼠海马NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达水平(P＜0.05)。
【结论】
1.证实乳酸能够改善LPS诱导的抑郁样行为。
2.乳酸能够抑制LPS诱导的炎症反应，其机制可能与其抑制促炎性因子TNF-α及IL-1β生成；抑制NF-κB的活化及NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)的激活有关。
本课题通过构建小鼠抑郁模型，拟证实乳酸能够改善脂多糖(LPS)诱导小鼠抑郁样行为，初步探究乳酸发挥抗抑郁作用的分子机制。
【方法】
1.使用不同浓度(0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg)LPS构建小鼠抑郁模型，通过检测悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验及动物体重等指标，选择合适的造模浓度及判断动物模型是否符合实验要求。
2.探究外源性乳酸对LPS诱导的小鼠抑郁模型行为学功能的影响。将实验动物随机分为正常组、生理盐水组(Nacl组)、乳酸组(LA组)、脂多糖+生理盐水组(LPS+Nacl组)、脂多糖+乳酸组(LPS+LA组)检测抑郁行为学功能指标的变化。
3.检测小鼠抑郁模型海马在LPS处理后0h、1.5h、6h、12h、24h、30h、48h乳酸的变化。
探究外源性乳酸是否能够通过血脑屏障(BBB)。将实验动物随机分为正常组和LA组，检测小鼠海马在LPS处理0h、0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、48h后乳酸的变化。
为了进一步了解外源性乳酸对LPS诱导海马乳酸变化的影响。将实验动物随机分为正常组、LPS+Nacl组、LPS+LA组，检测LPS处理后0h、0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、30h、48h海马乳酸的变化。
4.通过酶联免疫吸附法检测LPS在不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h)对海马促炎性因子TNF-α及IL-1β表达的影响。
探究外源性乳酸对LPS诱导促炎性因子变化的影响。将实验动物随机分为正常组、LPS+Nacl组、LPS+LA组，检测在不同时间点(0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h)对海马TNF-α及IL-1β表达的影响。
5.初步探究外源性乳酸对LPS诱导的NF-κB通路及NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)蛋白表达的影响。
【结果】
1.探究构建LPS小鼠抑郁模型的合适浓度。结果显示0.5mg/kg、0.7mg/kg及0.8mg/kgLPS均能够诱导抑郁样行为。具体表现在：悬尾实验及强迫游泳实验不动时间显著增加(P＜0.01)、蔗糖消耗率明显降低(P＜0.01)及LPS处理后6h、12h、24h体重显著下降(P＜0.01)。
2.探究外源性乳酸对LPS诱导小鼠抑郁模型行为学功能的影响。结果显示与Control组相比，Nacl组和LA组在悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验及体重等指标中无显著性差异(P＞0.05)。LPS+LA组相较于LPS+Nacl组悬尾实验、强迫游泳实验中不动时间显著减少(P＜0.001)，糖水偏好实验蔗糖消耗率明显升高(P＜0.01)，但是对体重并没有影响。
3.检测LPS诱导小鼠抑郁模型海马乳酸的变化。结果显示LPS处理后24h及30h乳酸有明显下降的趋势(P＜0.05)。而正常组海马在外源性乳酸注射后0.5h、1h、2h、6h、12h乳酸水平显著升高(P＜0.05)。进一步探究外源性乳酸对LPS诱导海马乳酸的影响，实验结果显示与LPS+Nacl组相比，LPS+LA组海马乳酸在2h、6h、12h、24h、30h明显升高(P＜0.05)。
4.检测LPS诱导海马促炎性细胞因子TNF-α及IL-1β表达的影响。结果显示与Control组相比，LPS组TNF-α在LPS注射后2h显著升高(P＜0.01)，而IL-1β在1h、2h、6h显著升高且在6h达到峰值(P＜0.01)。
探究外源性乳酸对LPS诱导的海马TNF-α及IL-1β表达的影响。结果显示，LPS+LA组相较于LPS+Nacl组海马TNF-α表达水平在2h明显下降(P＜0.01)，而IL-1β在6h显著降低(P＜0.05)。
5.初步探究外源性乳酸对LPS诱导的NF-κB通路的影响。Westernblot实验结果显示，与Control组相比，LPS组小鼠海马P-NF-κB在6h、12h、24h蛋白表达显著上调(P＜0.01)，而NF-κB蛋白表达没有显著变化(P＞0.05)。外源性给予乳酸后在6h、12h、24h显著下调抑郁小鼠海马P-NF-κB蛋白表达水平(P＜0.05)。
初步探究外源性乳酸对LPS诱导的NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)蛋白表达的影响。Westernblot实验结果显示，与Control组相比，LPS组小鼠海马NLRP3、ASC、Caspase-1在6h、12h、24h蛋白表达显著上调(P＜0.05)。而Pro-Caspase-1(前体Caspase-1)蛋白表达没有显著变化(P＞0.05)。外源性给予乳酸后在6h、12h、24h显著下调抑郁小鼠海马NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达水平(P＜0.05)。
【结论】
1.证实乳酸能够改善LPS诱导的抑郁样行为。
2.乳酸能够抑制LPS诱导的炎症反应，其机制可能与其抑制促炎性因子TNF-α及IL-1β生成；抑制NF-κB的活化及NLRP3炎性体(NLRP3、ASC、Caspase-1)的激活有关。