前言聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外快速扩增DNA的技术，每个循环包括变性、退火和延伸三个过程，每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍，经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近10~9倍，PCR是体外大量获得目的DNA片段的方法，便于对核酸分子作进一步的分析和检验。目前，PCR技术已广泛地应用于基础研究和应用研究。PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”，在基础研究中可用于克隆基因，并在此基础上对基因组DNA或线粒体DNA进行直接序列分析，检测突变位点，分析染色体重组等。在应用研究中则可用于遗传疾病的检测及产前诊断、法医学研究等。但是，目前普遍采用的商品化PCR装置一般以温控金属块加热塑料制成的PCR反应管，系统通常具有较大的体积和热容，常规PCR完成30个循环一般需2～3小时，其中大部分时间消耗于加热和冷却过程，即将金属块达到平衡温度并将热通过反应管传递至PCR反应液，因此，PCR难以实现高效和高通量。上个世纪90年代，人们开始将微流控芯片技术应用于PCR扩增。微流控芯片技术是近十年来迅速发展起来的一种新的微型分析系统，它采用微加工技术在厘米尺寸的玻璃、塑料及硅橡胶材料上刻蚀出微米尺寸的反应管道及分析元件，由于各种分析过程可在微米尺寸的结构中完成，一方面可使珍贵的生物试样与试剂消耗降低到微升甚至纳升级，费用大幅度下降，另一方面使分析速度成十倍、百倍地提高，实现高通量的检测。PCR装置的微型化不仅降低了PCR样品的消耗量，而且较低的热容量显著提高了系统的热传导效率，使PCR反应速度大大加快。目前，PCR微流控芯片系统主要有两种形式：微室静态型PCR芯片和连续流动型PCR芯片。前者是传统PCR的微型化，即将反应混合物固定在微反应池中，依赖于温度控制装置的温度循环变化进行热循环扩增，由于其是传统PCR的微型化，体积和热容减少，因此反应时间大大减少，能量消耗也大幅度的降低；而后者通过微加工形成逶迤形流路，在一定推动力的作用下，使PCR反应液连续流经三个不同的温区，完成变性、退火和延伸过程，其优点是其反应温度无需来回反复地快速升降。虽然这两种PCR微流控芯片系统能够快速、高效扩增目的DNA片段，并已成功地实现了与毛细管电泳分离、实时荧光检测以及阵列芯片杂交等过程的集成化，但由于系统通常包含复杂的加热/冷却元件以及液体驱动等系统，增加了制作的复杂性和成本，限制了其广泛应用。2002年，Krishnan等人在Science上首次报道了利用自然对流[Rayleigh Benard(瑞利-本纳德)对流]原理进行PCR扩增的方法，即将PCR反应液置于一个封闭的柱形反应腔内，反应腔的上下表面分别进行恒温控制，通常上端温度为61℃，下端温度为97℃，通过上下表面的温差驱动液体经过不同的温区，实现PCR扩增。该方法不需要改变器件的温度，也不需要外加驱动来实现样品的流动，只需要一个反应腔，并控制其上下两端的温度为恒温，就可以实现PCR扩增。2004年，该研究小组采用类似系统在5×5的反应块上进行了完成高通量PCR扩增的尝试。在上述研究基础上，进一步探讨和改善该系统的效能是其广泛应用的基础，为此本研究首次在装置构成、温度控制、材料表面处理等方面对对流PCR的应用效能进行了系统的探讨，为该系统的实际应用提供了有意义的实验依据。实验材料与方法选取聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯、聚氨酯和树脂玻璃作为反应腔的制作材料，将其分别经过加热煮沸、在其表面钻孔、高压灭菌处理后，将没有发生变形和熔化的材料加到PCR反应液中进行扩增，选择对PCR扩增无影响的PC为反应腔材料。反应的温度控制系统由上、下两部分构成，分别用于控制体系的上、下端温度。上、下端均通过80mm×50mm×30mm的加热铝块进行加热。上端铝块通过橡胶管与恒温水浴相连，以维持加热铝块为恒温，温度通过测温器进行实时监测。下端铝块内插入陶瓷加热棒进行加热，由PID控制模式的温度控制器和继电器控制陶瓷加热棒的温度。反应过程为将上、下端的加热铝块分别设置为反应所需要的温度，待温度稳定后用微量加样器将新配制的PCR混合液无气泡地注入约30μl体积的反应腔中，用PCR专用封口膜封口。然后将反应腔放在两个铝块之间，使用螺杆将铝块均衡固定，进行热循环反应20min。在基本装置基础上，分别对反应装置、反应腔内表面和上端温度进行了以下优化：(1)考虑到反应腔周围厚度对扩增的影响，分别制作了尺寸为60mm×6mm×15mm和100mm×100mm×15mm的反应块进行PCR扩增，以选择合适的反应块尺寸；(2)为了避免外界环境温度的波动影响液流循环状态，采用泡沫塑料及木板对反应块进行了隔热处理；(3)为了减少反应腔对反应液的吸附，在反应体系中加入浓度为25mg/ml的BSA 5μl(终浓度为2.5％)，以未加入BSA的等体积反应体系作为对照；(4)为进一步提高系统的扩增效率，扩大其应用范围，本研究考察了45℃、47℃、50℃、55℃、60℃和65℃六个不同上端温度下的系统扩增效率，下端温度设置为99℃。实验结果选取拟用于反应腔制作的聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯、聚氨酯和树脂玻璃材料在分别经过筛选后，只有PC材料未发生变形和熔化，并且对PCR扩增没有影响。以聚碳酸酯为反应腔材料，分别以PCR产物、质粒DAN和噬菌体DNA为模板进行扩增反应，高效扩增了长度为100bp-750bp的DNA片段。在对反应块进行隔热处理后，统计结果显示，经过隔热处理的PCR扩增结果的阳性率高于未经处理者，表明经过隔热处理的系统的温度系统更稳定，利于PCR扩增。但是，在同一个反应块上并行排列的不同反应腔内加入相同的PCR反应液，同时在对流PCR系统上进行PCR扩增，结果显示，不同反应腔中的扩增效率呈现明显差异；在反应块的同一反应腔内进行PCR扩增的重复实验，每次的扩增条件完全相同，结果显示，不同反应批次的扩增效率呈现明显差异，扩增效率仍然不能达到100％。将反应腔下端温度固定为99℃，上端分别设置为45℃、47℃、50℃、55℃、60℃和65℃六个不同的温度，结果显示，上端温度为55℃时扩增效率最高，其它温度条件下扩增效率有所降低。可能的原因是当上端为55℃时，Ra数值在对流形成的最佳范围内，能形成稳定的对流循环；当上端小于55℃时，加大了上、下端的温差，一方面会导致湍流趋势，另一方面使体系的温度梯度分辨率降低，使反应组分在特定温区的停留时间减少，不利于扩增；当上端大于55℃时，会降低对流形成趋势，扩增效率会明显降低。反应腔上下端温度分别为55℃和99℃，在PCR反应液中加入终浓度为2.5％的BSA，进行PCR扩增，结果显示加入BSA组的扩增效率明显优于未加入BSA组，说明BSA减少了反应腔材料对反应液的吸附。此外，使用宽窄两种不同尺寸的反应块进行PCR扩增时，在窄反应块上可以对目的片段进行有效扩增，而在宽反应块上则未得到目的片段的扩增产物，电泳检测呈弥散状分布，可能的原因是宽反应块上的反应腔周围被较厚的材料所包围，无法进行必要的热量传导与扩散，导致在反应腔内部不能形成均匀的温度梯度，影响对流的形成。结论本研究在装置构成、温度控制、材料表面处理等方面对微流控自然对流PCR系统的应用效能进行了系统的考察和评价，为该方法的实际应用提供了有意义的实验依据。经过系统优化，提高了其扩增效率和应用范围，可在20min内对100bp-750bp较大范围内的DNA片段实现高效扩增。但研究也发现系统中稳定对流的形成需要较为严格的温度控制，是普通实验室难以实现的，从某种程度上会限制该系统的广泛应用。