第一部分Galectin-1在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的分布、定位和表达目的:通过形态学方法和分子生物学方法研究氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中半乳糖凝集素Galectin-1(Gal-1)的分布、定位和表达情况。方法:172只7日龄(P7)C57BL/6J幼鼠随机分为正常对照组和OIR模型组。正常对照组幼鼠在正常氧环境中饲养。OIR模型组小鼠依据Smith方案建立氧诱导视网膜病变模型,建模方法简述如下:P7小鼠放入氧箱,控制氧浓度75%± 1%,连续暴露5 d后,P12取出氧箱,继续在正常氧环境中饲养,形成视网膜新生血管。取两组中P17小鼠眼球行石蜡包埋后制作病理切片行H&E染色,计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数目。取两组中P12、P14、P17、P19小鼠眼球行全视网膜铺片免疫荧光染色,研究视网膜新生血管、无灌注区及缺氧区等情况。取两组P17小鼠眼球行全视网膜铺片,行Gal-1抗体染色,研究视网膜上Gal-1的分布情况。取两组中P17小鼠眼球行冰冻切片免疫荧光染色,研究Gal-1在视网膜上的定位情况。取P12、P14、P17、P19小鼠视网膜,采用蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测各组小鼠各时间点视网膜上Gal-1蛋白的表达情况。取P17小鼠视网膜,Western blot法和RT-PCR法检测两组Gal-1的表达情况。结果:石蜡切片H&E染色计数结果显示,P17时OIR模型组新生血管内皮细胞核数目多于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示OIR模型建立成功。全视网膜铺片免疫荧光显示,OIR模型组小鼠视网膜P12即出现中央区的无灌注区和缺氧区,而在P14隐约可见无灌注区、缺氧区和中周部血管区交界处出现小片样新生血管,P17中央区出现大面积无灌注区,中周部形成大量新生血管团簇;而正常对照组小鼠P12、P14、P17、P19均为发现无灌注区和新生血管的形成。Western blot检测显示,OIR模型组的表达随时间推移而上升,P17到达顶峰,P19下降,这与全视网膜铺片显示OIR模型组新生血管形成的趋势是一致的(P<0.05);而正常对照组Gal-1的表达无明显变化。通过Western blot和RT-PCR法比较两组蛋白质和mRNA水平,发现OIR模型组P17视网膜的Gal-1蛋白和mRNA水平与正常组相比,都明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。全视网膜铺片Gal-1染色显示,P17小鼠视网膜Gal-1分布区域与视网膜新生血管分布区域相一致。冰冻切片免疫荧光结果显示,P17 OIR模型组中Gal-1染色比正常对照组显著增强,主要定位于视网膜神经节细胞层(GCL),内丛状层(IPL)和内核层(INL)。结论:首先我们成功的建立了 OIR小鼠模型。在OIR模型组中,Gal-1的蛋白表达与视网膜新生血管的增殖过程趋势一致,且形态学检测也显示Gal-1的分布和定位与视网膜新生血管具有密切联系。这些都提示Gal-1可能成为促进视网膜新生血管形成的重要因子之一。第二部分Galectin-1选择性抑制剂OTX008对视网膜新生血管形成的作用目的:通过玻璃体腔注射Galectin-1(Gal-1)的选择性抑制剂OTX008,初步探索OIR小鼠视网膜Gal-1抑制后,视网膜新生血管形成和无灌注区的变化。方法:将88只7日龄(P7)C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、OTX008干预组、OIR模型组和PBS空白对照组。正常对照组:小鼠与母鼠一起在正常环境下饲养,OIR模型组:按前述方法建立。OTX008治疗组:建立OIR模型,P12时给予0.25 μg/ul的OTX008,体积1μl。PBS空白对照组:建立OIR模型,P12时给予1μl的PBS作为空白对照。取各组P17小鼠视网膜行Western blot检测,研究Gal-1蛋白的抑制情况。取P17各组小鼠眼球行H&E染色,计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数。取P17各组小鼠视网膜行全视网膜铺片免疫荧光染色,观察视网膜血管的变化,无灌注区和缺氧区的变化。结果:小鼠玻璃体腔注射Gal-1的选择性抑制剂OTX008,成功的抑制了 OIR小鼠视网膜上的Gal-1蛋白水平。H&E染色新生血管内皮细胞核计数显示,OTX008干预组视网膜新生血管内皮细胞核数目较OIR模型组和PBS空白对照组都显著减少(P<0.05)。全视网膜铺片荧光染色显示,OTX008干预组新生血管区面积、无灌注区面积和缺氧区面积均小于OIR模型组和PBS空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Gal-1特异性抑制剂OTX008可有效的抑制OIR视网膜上Gal-1的蛋白质水平,从而抑制视网膜新生血管生成,并有效减少无灌注区和缺氧区,提示Gal-1具有促新生血管形成的作用。第三部分Galectin-1小干扰RNA重组腺病毒的构建、包装与鉴定目的:设计并构建携带有增强型绿色荧光蛋白EGFP标签,并针对半乳糖凝集素Galectin-1(Gal-1)的小干扰RNA重组腺病毒载体。方法:本课题利用siRNA设计软件依照siRNA的设计原则,设计出Gal-1的siRNA的核心序列,并依据此核心序列合成Gal-1的siRNA双链片段。将此片段与经AgeI和EcoRI酶切的病毒载体穿梭质粒进行连接,然后将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞。通过测序方法鉴定阳性克隆的大肠杆菌的阳性菌落,证实Gal-1-RNAi基因片段成功的连入了穿梭质粒,并且重组为hU6-Gal-1-Ubi-EGFP。该穿梭质粒与辅助质粒pBHG lox △E1,3Cre共转染至HEK293细胞,通过腺病毒AdMax包装系统Cre/loxP重组酶系统作用来实现重组,生成重组腺病毒。最后采用终点稀释法来测定病毒的滴度以供使用。结果:经过测序方法鉴定阳性克隆的大肠杆菌阳性菌落,证实Gal-1-RNAi基因片段成功的连入穿梭质粒,并重组成为hU6-Gal-1-Ubi-EGFP;后经扩增纯化,测得 Ad-Gal-1-RNAi-EGFP 的滴度为 1.O×109PFU/ml。结论:成功设计并构建了携带EGFP标签,针对小鼠Gal-1基因siRNA片段重组腺病毒Ad-Gal-1-RNAi,经过纯化后得到较高的滴度,为进一步研究Gal-1在视网膜新生血管性疾病的作用和机制提供了实验工具。第四部分Galectin-1基因沉默对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用目的:采用玻璃体腔注射途径给予Ad-Gal-1-RNAi重组腺病毒,沉默OIR小鼠视网膜Gal-1基因,研究Gal-1基因沉默后,OIR小鼠视网膜新生血管的变化。方法:116只7日龄(P7)C57BL/6J小鼠随机的分为正常对照组、OIR模型组、基因沉默组和空白载体组。其中,正常对照组幼鼠与其母鼠共同在正常氧环境中饲养。其余三组依据Smith经典方案建立OIR小鼠模型。OIR模型组小鼠:除建模外不给予其他任何处理。基因沉默组:OIR建模后于P12拿出氧箱后,即给予玻璃体腔注射体积1μl浓度为1.O×109 PFU/ml的Ad-Gal-1-RNAi。空白载体组,OIR小鼠P12给予1μl的1.0×109PFU/ml的Ad-EGFP(阴性对照病毒)。取基因沉默组P17小鼠和正常对照组P17小鼠,各10只眼,行视网膜冰冻切片观察病毒转染情况。取各组中P17小鼠眼球行石蜡切片,H&E染色,计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数目。取各组P17小鼠眼球制作全视网膜铺片,行免疫荧光染色,观察视网膜新生血管、无灌注区及缺氧区的变化。取各组P17小鼠视网膜组织,行Western blot和RT-PCR检测各组小鼠视网膜上Gal-1的蛋白水平和mRNA水平的表达变化。结果:OIR小鼠玻璃体腔注射重组腺病毒Ad-Gal-1-RNAi后,P17时通过共聚焦荧光显微镜观察到视网膜神经节细胞(GCL)、内从状层(IPL)、内核层(INL)等出现了病毒绿色强荧光,外丛状层(OPL)和外核层(ONL)隐约可见少量弱荧光,说明Ad-Gal-1-RNAi成功转染至视网膜,且病毒转染层次与前述研究Gal-1在OIR视网膜上的定位一致。Western blot和RT-PCR结果也显示基因沉默组的Gal-1蛋白和mRNA表达水平与OIR模型组和空白载体组相比,显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),说明Ad-Gal-1-RNAi转染成功抑制了视网膜上Gal-1的mRNA和蛋白质水平的表达。H&E染色新生血管核计数结果显示,基因沉默组突破内界膜的新生血管细胞核明显少于OIR模型组和空白载体组(P<0.05)。H&E染色新生血管内皮细胞核计数结果显示,基因沉默组突破内界膜的新生血管细胞核明显少于OIR模型组和空白载体组(P<0.05),提示Gal-1基因沉默具有抑制新生血管形成的作用。视网膜铺片免疫荧光结果显示,基因沉默组视网膜新生血管区面积、无灌注区面积和缺氧区面积均显著小于OIR模型组和空白载体组(P<0.05),亦说明Gal-1基因沉默具有抑制新生血管的作用。结论:Ad-Gal-1-RNAi能够有效且快速的转染至小鼠视网膜内层组织,并成功沉默Gal-1基因的表达。Gal-1基因沉默后可显著抑制视网膜新生血管的形成,并改善视网膜缺氧情况。第五部分Galectin-1基因沉默对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用机制的研究目的:采用玻璃体腔注射途径给予Ad-Gal-1-RNAi重组腺病毒,沉默OIR小鼠视网膜Gal-1基因,利用分子生物学的实验方法,探索Gal-1基因沉默后,小鼠视网膜新生血管抑制的可能机制。方法:48只7日龄(P7)C57BL/6J小鼠随机的分为正常对照组、OIR模型组、基因沉默组和空白载体组。其中,正常对照组幼鼠与其母鼠共同在正常氧环境中饲养。其余三组依据前述方法建立OIR模型。OIR模型组小鼠:不给予其他任何处理;基因沉默组:在OIR小鼠P12拿出氧箱后,即给予玻璃体腔注射体积1μl浓度为1.0× 109 PFU/ml的Ad-Gal-1-RNAi;空白载体组,OIR小鼠P12给予1μl的1.0×109PFU/ml的Ad-EGFP(阴性对照病毒)。取各组P17小鼠视网膜组织,行蛋白质免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR法检测各组小鼠视网膜上Nrp-1和Bcl-2的蛋白水平和mRNA水平的表达变化。结果:OIR小鼠玻璃体腔注射重组腺病毒Ad-Gal-1-RNAi后,Western blot检测显示基因沉默组Bcl-2和Nrp-1的蛋白相对表达量较OIR模型组和空白载体组都下调,差异具有统计学意义(P<0.05),RT-PCT检测显示基因沉默组Bcl-2和Nrp-1的mRNA相对量较OIR组和空白载体组均下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Ad-Gal-1-RNAi能够有效且快速的转染至小鼠视网膜内层组织,并成功沉默Gal-1基因的表达。Gal-1基因沉默后,其受体Nrp-1的表达下降,减少其下游因子Bcl-2的表达,阻止了它们的促新生血管作用,从而抑制了视网膜新生血管的形成。第六部分Galectin-1基因沉默对血管正常化的作用及其机制目的:研究Gal-1基因沉默对OIR小鼠视网膜血管正常化的作用并探索其可能的机制。方法:44只7日龄(P7)C57BL/6J小鼠随机的分为基因沉默组和空白载体组。两组小鼠首先按照Smith方案建立OIR小鼠模型。基因沉默组:在OIR小鼠P12拿出氧箱后,即给予玻璃体腔注射体积1μl浓度为1.0×109 PFU/ml的Ad-Gal-1-RNAi。空白载体组:OIR小鼠P12给予1μl的1.0×109PFU/ml的Ad-EGFP(阴性对照病毒)。P17时两组小鼠均采用心脏灌注法给予Concanavalin A。随后全视网膜铺片免疫荧光染色ConcanavalinA、NG2和CD31,采用Concanavalin A+/CD31+和NG2+/CD31+的比值检测视网膜血管有效灌注和周细胞覆盖率,从而评估血管正常化情况。Western blot法检测ROCK通路下游靶点MYPT-1的相对磷酸化情况。结果:基因沉默组的ConcanavalinA+/CD31+和NG2+/CD31+的比值均高于空白载体组,差异有统计学意义(P<0.05),提示Gal-1的基因沉默改善了视网膜有效灌注率,提高了周细胞覆盖率,促进了 OIR视网膜无血管区的血管正常化,Western blot的检测结果显示MYPT-1磷酸化程度受到抑制,提示血管正常化的作用可能来自于对ROCK通路的抑制。结论:Gal-1基因沉默改善了 OIR小鼠视网膜的缺氧情况,提高了视网膜的有效灌注率和周细胞覆盖率,促进了无血管区的血管正常化。Gal-1基因沉默促进OIR小鼠视网膜血管正常化的机制可能源于Gal-1基因沉默对ROCK通路的抑制。