4种膳食纤维的生物活性比较及经P13K通路改善HepG2细胞IR机制探讨

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目的:(1)提取全谷豆复合包、全大豆、全谷物小麦、全谷物玉米中膳食纤维,了解其含量、理化性质和体外抗氧化能力的不同;(2)观察单一和复合膳食纤维对高糖诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞的影响,掌握4组膳食纤维对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用及差异;(3)探讨单一和复合膳食纤维对胰岛素抵抗HepG2细胞PI3K信号通路的影响,初步探明其作用机制。方法:(1)用酶-化学法提取全谷豆复合包、全大豆、全谷物小麦、全谷物玉米中的膳食纤维;(2)按国标法测定4种膳食纤维的含量和组成,测定4种膳食纤维的膨胀率、持水力、不饱和脂肪(花生油)吸附力、饱和脂肪(猪油)吸附力、胆固醇吸附能力和葡萄糖透析延迟指数比较其物理性质,并通过DPPH自由基清除率和总抗氧化能力(T-AOC)法测定其体外抗氧化能力;(3)使用高浓度葡萄糖诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型。通过MTT法,结合葡萄糖消耗量、糖原累积量以及细胞中甘油三酯(TG)含量的测定,确定建立体外胰岛素抵抗模型的最佳时间和最佳浓度;(4)检测各组膳食纤维对胰岛素抵抗HepG2细胞的影响。实验分为空白对照组、二甲双胍阳性对照组、全谷豆复合包膳食纤维组、全大豆膳食纤维组、全谷物小麦膳食纤维组、全谷物玉米膳食纤维组,培养液中加入各组膳食纤维进行干预,干预后测定各组细胞的葡萄糖消耗量、糖原含量、TG含量和抗氧化指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平以及糖代谢指标丙酮酸激酶(PK)的活力。采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(Elisa)测定磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶-蛋白激酶B(PKB/Akt)、磷酸化糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、脂肪酸合成酶(FAS)的含量;运用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定丝氨酸/苏氨酸激酶-蛋白激酶B(PKB/Akt)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、脂肪酸合成酶(FAS)的nRNA表达;通过PI3K的抑制剂WT预处理抑制Akt蛋白磷酸化后,进一步观察各组膳食纤维对胰岛素抵抗HepG2细胞的影响。结果:(1)全谷豆复合包、全大豆、全谷物小麦、全谷物玉米均含有丰富的膳食纤维,具有较强的体外抗氧化能力;全大豆膳食纤维(DF)的持水力和膨胀力最好,全谷豆复合包DF次之,全谷物小麦DF和全谷物玉米DF较差;全谷物小麦DF的油脂吸附能力最好,全谷豆复合包DF次之,全大豆DF和全谷物玉米DF较差;全谷豆复合包DF的胆固醇的吸附能力最好,全大豆DF次之,全谷物小麦DF和全谷物玉米DF较差;全谷豆复合包DF的葡萄糖透析延迟能力在6个时间点中有4个时间点都表现最好。总体来看,全谷豆复合包DF均具有更好的葡萄糖透析延迟能力和胆固醇吸附能力,较好的持水力、膨胀力和油脂吸附能力,说明全谷豆复合包膳食纤维可以综合单一来源膳食纤维的优点。(2)浓度为150mmol/L葡萄糖作用HepG2细胞24h时,细胞葡萄糖的消耗量显著降低,糖原含量显著下降,TG含量显著升高,是诱导HepG2细胞形成胰岛素抵抗的最佳浓度;(3)与模型组相比,200μg/mL的膳食纤维对高糖诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞作用24h对细胞活性具有明显保护作用,因此将200μg/mL的膳食纤维干预24h确定为干预条件。干预后,与模型组相比:①膳食纤维显著提高了细胞对葡萄糖的摄取能力(P<0.05);②糖原含量显著增加,具有显著性差异(P<0.05);③显著降低了细胞中TG的含量(P<0.05);④MDA含量显著降低(P<0.05);⑤升高了SOD含量(P<0.05);⑥丙酮酸激酶活力明显升高(P<0.05);⑦p-Akt、p-GSK-3β、FAS含量显著降低(P<0.05)。实验结果表明,单一和复合膳食纤维对胰岛素抵抗均具有一定的改善作用,而复合膳食纤维的改善作用更为全面;(4)与模型组相比,各干预组细胞内Akt、GSK-3β基因表达显著增高(P<0.05),FAS基因表达显著降低(P<0.05)。未经抑制剂WT处理组比处理组改善效果明显,提示高糖诱导的HepG2胰岛素抵抗模型PI3K/Akt信号通路受到抑制,膳食纤维可以通过此通路起到改善作用,且复合膳食纤维组比单一膳食纤维组作用明显。结论:(1)全谷豆复合包、全大豆、全谷物小麦、全谷物玉米均富含膳食纤维,而全谷豆复合包膳食纤维可以综合单一来源膳食纤维性质的优点,在持水力、膨胀力、油脂吸附力、胆固醇吸附能力及葡萄糖透析延迟能力方面具有更好的综合能力;全谷豆复合膳食纤维具有更强的体外抗氧化能力;(2)150mmol/L的葡萄糖作用HepG2细胞24h可形成理想的胰岛素抵抗细胞模型;(3)4组膳食纤维均能改善HepG2细胞胰岛素抵抗状态,一定程度上保护细胞正常的糖脂代谢功能,且复合膳食纤维组比单一来源膳食纤维组具有更好的综合作用;(4)未经抑制剂WT处理组比处理组对HepG2细胞PI3K/Akt通路中Akt、GSK-3β、FAS的改善效果更明显,提示高糖诱导的HepG2胰岛素抵抗模型PI3K/Akt信号通路受到抑制,而膳食纤维可能通过此通路起到对Akt、GSK-3β、FAS的改善作用。
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