骨性关节炎(Osteoarthritis OA)是人类最常见的关节疾病,它是一种以关节软骨的变性和破坏为特征的慢性关节炎性疾病,多见于中老年人群。骨关节炎的具体发病机制不明,给早期的临床治疗带来了一定困难。早期的骨性关节炎多采用药物对症治疗,目前常用的治疗OA的药物主要包括非甾体抗炎药、硫酸氨基葡萄糖、局部应用激素及透明质酸等,这些药物能在一定程度上缓解OA的症状,但并不能从根本上缓解OA的进展。目前已有较多的研究证实雌激素与骨关节炎的发生有明显相关性,对OA有一定的保护作用,而我们的一些前期研究则发现脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone, DHEA)对兔骨关节炎模型具有明显的保护作用。DHEA是一种人类和灵长类动物肾上腺大量分泌的一种性激素前体,最终转化为雄激素或雌激素,目前关于DHEA的研究涉及很多领域,例如动脉粥样硬化,癌症,糖尿病,肥胖,老龄化,还有炎性关节炎等。虽然我们发现DHEA对兔OA具有保护作用,但其机制还不明确。目前尚未发现DHEA的组织受体,并且,在某些物种的外周组织DHEA可转化为雌激素和雄激素。因此,在前期研究的基础上,我们进一步研究DHEA对OA的保护作用是其直接作用还是通过代谢为下游激素从而起到保护作用。本次研究主要分三部分：一、首先进行兔软骨细胞培养,加入不同浓度的DHEA进行干预,用白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)对软骨细胞进行刺激,探索DHEA对兔软骨细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的基因表达的影响。我们的研究发现DHEA可抑制IL-1β介导的MMP-13的基因水平表达；增强TIMP-1的基因水平表达；并提高Ⅱ型胶原的基因水平表达。二、在第一部分实验的基础上,我们探索了DHEA在骨关节炎软骨细胞中的局部代谢,并且研究了芳香酶抑制剂和雌激素受体阻滞剂对软骨细胞OA相关分子表达的影响。我们发现兔骨关节炎软骨细胞有局部代谢DHEA的能力,在代谢过程中出现了明显的甾体激素合成相关酶如3β-HSD、17β-HSD、P450的基因表达,能在局部合成睾酮和雌二醇。在加用了芳香酶抑制剂来曲唑(Letrozole)和雌激素受体阻滞剂ICI182,780后,MMP-3、MMP-13的表达水平均升高,两药同时作用时升高更明显；Col-Ⅱ、TIMP-1的表达水平则降低,两药同时作用时降低更明显。三、我们在前面体外研究的基础上,观察在ACLT动物模型中,通过关节腔注射DHEA以及芳香酶抑制剂来曲唑和雌激素受体阻滞剂ICI182,780,来观察DHEA在动物实验中的抗OA作用及是否通过下游激素起作用。我们发现来曲唑通过影响DHEA转化为雌激素和ICI182,780通过影响雌激素结合起作用都影响了DHEA的保护作用。我们的研究结果提示DHEA很可能是通过代谢为下游激素起到对OA的保护作用。第一部分DHEA对兔软骨细胞中MMP-13和TIMP-1表达的影响目的：观察DHEA对IL-1β刺激的兔软骨细胞MMP-13/TIMP-1、Ⅱ型胶原表达的影响。方法：取兔骨关节软骨标本,用酶消化法提取软骨细胞,并进行兔软骨细胞培养。取第三代软骨细胞,加入不同浓度的DHEA,然后用IL-1β刺激,24小时后收取细胞。用实时定量PVR法检测软骨细胞Ⅱ型胶原、MMP-13和TIMP-1的基因表达变化。结果：DHEA可抑制兔软骨细胞中IL-1β介导的MMP-13的基因表达,提高软骨细胞中Ⅱ型胶原、TIMP-1的基因表达。结论：DHEA可抑制IL-1β介导的MMP-13的基因水平表达；增强TIMP-1的基因水平表达；提高Ⅱ型胶原的基因水平表达。第二部分DHEA在兔关节软骨细胞培养环境下的代谢及对OA保护作用机制目的：观察兔OA软骨细胞中DHEA的代谢、下游激素水平和其中相关酶类表达水平。方法：软骨细胞用10μM的DHEA预处理4小时,然后加入几-1β(最终浓度10ng/ml),继续孵育,收取0,0.5,1,2,4,6,8,12,24,36,48,60,72小时的培养基用ELISA法进行DHEA、睾酮、雌二醇测定,收取24小时软骨细胞用Westeren blot检测甾体激素合成相关酶3β-HSD、17β-HSD、P450的蛋白表达。在观察来曲唑抑制实验中,我们分成五组：A组(DHEA+IL-1β);B组(DHEA+来曲唑+IL-1β)；C组(DHEA+ICI+IL-1β);D组(DHEA+来曲唑+ICI+IL-1β);E组(对照组,单加IL-1β,收取24小时软骨细胞进行Westeren blot及PCR检测MMP-3, MP-13,TIMP-1和Col-Ⅱ的表达水平。结果：骨关节炎软骨细胞能够局部利用DHEA,其下游激素睾酮、雌二醇及甾体激素合成相关酶类3β-HSD、17β-HSD、P450基因均出现明显升高。在加用了芳香酶抑制剂来曲唑(Letrozole)和雌激素受体阻滞剂ICI182,780后,MMP-3、MMP-13的表达水平均升高,两药同时作用时升高更明显；Col-Ⅱ、TIMP-1的表达水平则降低,两药同时作用时降低更明显。结论：兔骨关节炎软骨细胞有局部代谢DHEA的能力,能在局部合成睾酮和雌二醇。通过芳香酶抑制剂来曲唑和雌激素受体阻滞剂ICI182,780作用软骨细胞,能够降低DHEA对关节炎软骨细胞的保护作用,说明DHEA是通过下游激素的从而起到对关节炎软骨细胞的保护作用。第三部分DHEA对兔OA动物模型的保护作用及其代谢对结果的影响目的：观察DHEA在动物实验中的抗OA作用及是否通过下游激素起作用。方法：取30只新西兰大白兔,用右膝前交叉韧带切断(ACLT)法制作OA模型。术后随机分为5组,每组6只,分别为对照组(E组),A组,B组,V组,D组。关节腔注射从术后第一天开始,每周一次,持续9周。末次注射后1周取右膝关节(股骨侧),进行形态学、组织学观察,并用实时定量PCR法检测关节软骨中MMP-13、TMP-1、Ⅱ型胶原的基因表达。结果：在ACLT动物模型中,组织学评分提示单加DHEA组的评分是最高的,加来曲唑和ICI182,780都使评分降低了,当两药同时作用时其评分是最低的。来曲唑通过影响DHEA转化为雌激素和ICI182,780通过影响雌激素起作用都影响了DHEA的保护作用。结论：DHEA很可能是通过体内代谢为下游激素而发挥对骨关节炎的保护作用。