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研究背景:在世界范围内子宫颈癌是一种常见的女性致死性恶性肿瘤,尽管子宫颈癌近年来的发病率和死亡率明显下降,它依旧在女性常见肿瘤中位居第四位。microRNAs(miRNAs)是一类单链非编码小RNA分子,其长度为18-24个碱基,可与靶m RNA通过碱基互补配对相结合,导致靶m RNA降解或者抑制其翻译。在过去的十几年中,在包括子宫颈癌在内的肿瘤领域,越来越多的研究表明miRNA扮演着一个重要调控者的角色。microRNA-501-5p(miR-501)是一种非保守的miRNA,作为肿瘤发生的潜在关键因子而出现。目前的证据表明miR-501在一些恶性肿瘤中过表达,包括肝癌,胃癌和通过促进细胞增殖作为癌细胞起作用的肺癌。此外,miR-501高表达可能是胃癌患者总体生存预测不良的指标。然而,miR-501对宫颈癌的影响和潜在机制尚未探索。CYLD基因位于染色体16q12.1上,编码去泛素化酶。CYLD基因突变与家族性圆筒瘤(FC),多发性家族性毛发上皮瘤(MFT)和多发性骨髓瘤相关。在肾癌,HCC和子宫颈玻璃状细胞癌细胞系中报道了CYLD的拷贝数减少。同时,在结直肠癌,乳腺癌和肺癌中发现抑制的CYLD基因表达。因此,CYLD被认为是肿瘤抑制剂。此外,据报道,CYLD与IκB激酶(IKK)复合物的组分IKKγ结合并负调节核因子-κB(NF-κB)活性。先前的研究已经证实CYLD是miR-501在肝细胞癌(HCC)细胞中的直接靶标。miR-501通过降低CYLD和增加细胞周期蛋白D1和c-myc表达来增强HCC细胞的增殖。目的:(1)探讨miR-501在子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。(2)确定子宫颈癌中miR-501与CYLD之间的调控关系,揭示miR-501作用的潜在机制。方法:(1)将miR-501模拟物(miR-501组)和无关序列(NC组)、miR-501特异性抑制物(501i组)和无关序列(NCi组)以及针对CYLD的小干扰RNA(si RNA)(si CYLD组)等通过脂质体lipofectamine 2000转染至人子宫颈癌He La细胞。(2)通过Taqman探针法实时定量RT-PCR(q RT-PCR)检测He La细胞中miR-501表达。采用SYBR Green q RT-PCR检测CYLD m RNA表达水平,Western blot检测CYLD、Bcl-2、Bax、NF-kB p65和磷酸化p65(p-p65)蛋白表达。(3)使用CCK-8和克隆形成实验确定miR-501对He La细胞增殖的影响。(4)划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验用来确定miR-501在He La细胞迁移和侵袭能力中的作用。(5)流式细胞术检测细胞凋亡。结果:(1)Western blot结果显示,与未转染的He La细胞(Control组)和NC组相比,miR-501上调(miR-501组)可导致CYLD蛋白显著降低(P<0.01),si CYLD组亦显示CYLD表达水平降低(P<0.01)。实时定量PCR结果显示,miR-501组和si CYLD组CYLD m RNA水平显著低于Control组和NC组(P<0.01)。与阴性对照组相比,敲低miR-501可导致CYLD的m RNA和蛋白水平显著上调(P<0.01)。(2)CCK-8实验结果显示,与Control组和NC组相比,miR-501组和si CYLD组细胞增殖显著增加(P<0.01)。miR-501组(689.3±32.3)和si CYLD组(646.0±29.6)的平均细胞集落计数明显高于Control组(379.0±13.0)和NC组(363.0±13.9)(P<0.01)。与上调实验结果相反,501i组与阴性对照组相比细胞增殖显著降低(P<0.05),平均细胞集落计数(207.7±10.7)也显著低于Control组(651.7±15.4),NCi组(644.2±17.6)和501i+si CYLD组(659.0±21.5)(P<0.01)。(3)划痕实验结果显示,与对照组和NC组相比,miR-501和si CYLD组伤口面积显著减小(P<0.01)。与之相反,501i组与Control组、NCi组和501i+si CYLD组相比伤口面积较大(P<0.01)。Transwell迁移实验结果表明,miR-501组和si CYLD组穿膜细胞数量(99.0±5.6;93.0±3.5)明显高于对照组(30.7±3.3)和NC组(33.3±3.2)。与Transwell迁移实验结果类似,miR-501和si CYLD组(86.4±3.7;81.7±5.0)与对照组(26.7±2.0)和NC组(28.3±1.8)相比,穿膜细胞数明显增多(P<0.01)。相反,miR-501下调可抑制He La细胞穿膜(伴或不伴基质胶)细胞数(P<0.01)。(4)Annexin V/Propedium Iodide凋亡检测结果显示,miR-501和si CYLD组(1.55%±0.10%;1.45%±0.05%)细胞凋亡百分比明显低于Control组(2.49%±0.12%)和NC组(2.41%±0.07%)(P<0.05)。相反地,501i组死亡细胞数(10.65%±0.47%)明显高于Control组(2.47%±0.02%)、NC组(2.39%±0.11%)和501i+si CYLD组(2.19%±0.07%)(P<0.01)。与Control组和NC组相比,miR-501上调和si CYLD敲低后,Bcl-2、NF-кB p65和p-p65蛋白表达上调,而Bax蛋白表达下调。结论:(1)在子宫颈癌He La细胞中miR-501在m RNA和蛋白两个水平下调CYLD表达。(2)miR-501促进子宫颈癌细胞增殖、迁徙和侵袭能力,至少部分是通过下调CYLD和激活下游的NF-kB p65来实现的。(3)miR-501可能是子宫颈癌潜在的治疗靶点。