花鲈作为一种重要的水产经济鱼类,生长快速且能在较大温度范围和不同盐度下进行养殖,是一种极好的水产动物研究的模式生物。花鲈分布广,遍布在东亚沿海和河口。由于野生资源有限,花鲈在中国的养殖变得越来越重要。目前的研究主要集中在遗传标记、发育、基因图谱构建以及与生殖、环境压力、生长和免疫相关的功能基因分析。花鲈被淡化处理后,能够在淡水中进行养殖,然而,在完全脱离海水后,成鱼不能够实现完整的繁殖过程,这也是花鲈不能够在内陆大规模养殖的主要阻碍。本研究中,我们主要以花鲈为实验材料,基于HPG轴(Hypothalamus-pituitary-gonad axis),对花鲈的脑、性腺进行转录组测序,得到若干有明显表达差异的重要生殖基因,并对cyp19a结合其启动子DNA甲基化进行较为系统分析。主要研究结果如下:1.脑、性腺转录组数据分析取成年花鲈鱼脑、性腺,提取总RNA,采用Illumina HiSeq 2000高通量技术平台进行测序。共计产生78,256,909条clean reads,拼接得到274,909条contigs。根据序列同源性分析,注释得到31,683条unigenes,其中20,702条unigenes出现在8237个GO terms和3888个信号通路中。26,623条unigenes在所有的组织中均存在,然而,748,349和319条unigenes分别特异存在于脑、卵巢和精巢中。此外,在脑与卵巢、卵巢与精巢和脑与精巢之间比较,发现分别有671/367、496/315和1668/580条unigenes出现上调或下调。通过同源性分析,获得脑-性腺轴中表达的生殖相关基因,其中包括那些参与性别分化和性别维持的基因。这些数据为花鲈的研究提供了较为完整基因资源,为HPG轴基因的功能、生殖调节以及性别基因的表达奠定基础。2.下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴相关的基因的鉴定及其表达分析通过转录组数据分析,对所得到的所有基因进行鉴定,其中,56个基因存在于Gn RH信号通路(KEGG No.map04912),31个基因存在于类固醇生成通路(KEGG No.map04912)中。例如Gn RH受体,LH,FSH,LH受体,LSH受体,雄激素受体(AR),雌激素受体(ER),GSDF,CYP19a等。其中6个基因在不同发育时期以及不同组织的表达实验表明,cyp19a主要在性腺以及脑中有表达,极少在其他组织中有表达;另一激素合成酶,3β-HSD广泛表达与所取的七个组织中;AR和ER在七个组织中也都有表达;与卵巢相比,GSDF更显著地表达与精巢;PIWI特异性地表达于精巢和卵巢。3.MSAP方法检测花鲈脑以及性腺组织基因组的DNA甲基化情况在花鲈鱼脑、精巢以及卵巢组织中,设计8对选择性扩增引物,在100-1000bp之间,分别共计产生596、580和796条扩增条带,其中每个个体8对组合引物平均获得149、145和199个条带,花鲈脑、精巢以及卵巢组织的基因组DNA甲基化指数分别为为34.23%、38.62%和47.74%。4.BSP法检测花鲈脑、性腺组织中cyp19a基因启动子的甲基化状态通过Genomic Walking方法,PCR扩增克隆得到花鲈cyp19a基因启动子序列,用亚硫酸盐分别处理脑、精巢以及卵巢基因组DNA,扩增分别得到处理后三组织的启动子序列,通过TA克隆、生工测序对三组织启动子序列Cp G位点进行甲基化分析。结果显示:cyp19a基因启动子在精巢以及脑组织中的甲基化程度明显高于卵巢,均约是其2倍。启动子甲基化水平和cyp19a基因在3组织中的表达呈负相关。5.cyp19a启动子体外转录功能分析通过构建PGL-Basic-cyp19a荧光素酶报告载体,我们对花鲈cyp19a启动子在体外活性进行分析。结果表明,去除-140至-46这段区域后,cyp19a启动子活性明显降低(降低约58.90%),所以较长的启动子片段表现出相对较高的转录活性。由此我们推断:包含若干转录因子结合位点SF-1,SOX,PPARE,CRE,and TATA box的区域对于调节cyp19a启动子活性起着非常关键性的作用,而Cp G甲基化能抑制启动子的转录活性。