研究目的:临床上膀肮尿路上皮癌(Urinary bladder carcinoma,UBC)是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一,严重影响人类的生命健康。膀胱癌的治疗主要以手术治疗为主,同时辅以化疗治疗,包括膀胱腔内灌注化疗或者根治手术术前或者术后辅助系统化疗(静脉给药)是重要的治疗手段。膀胱癌的化疗耐药性的产生和随后的肿瘤复发是膀胱癌治疗失败重要的因素。其中肿瘤的耐药与肿瘤复发作用有很大一部分原因是由肿瘤起始细胞亚群即癌症干细胞(Cancer stem cells,CSCs)所驱动。有文献报道,化疗能够诱导肿瘤干细胞的富集,而肿瘤干细胞是一群具有自我分化和不断复制能力的细胞群体,肿瘤干细胞的富集和存在是肿瘤耐药性产生和肿瘤复发、进展的重要因素。然而,化疗药物治疗诱导的CSCs富集,特别是UBC的化疗耐药的产生和癌症复发的研究较少,其潜在分子机制仍不清楚。我们拟通过动物体内、体外细胞实验和临床组织标本实验进行检测和分析化疗耐药的分子机制,并探讨可能的临床应用价值。研究方法:采用动物体内和体外细胞实验研究双重方案,首先,通过在体内建立人类膀胱尿路上皮癌细胞系(T24和5637)裸鼠皮下移植瘤,用以模拟人类临床膀胱癌的治疗方式。构建体内裸鼠皮下移植瘤模型,随后采用吉西他滨联合顺铂的化疗方案(Gemcitabineandcisplatin,GC)模拟人类膀胱癌治疗策略进行周期性的化疗治疗,分别在第1,5,8和15天时予40mg/kg的吉西他滨腹腔注射治疗,同时在第2天时给予小鼠60mg/kg顺铂腹腔注射治疗,随后小鼠有15天的治疗恢复期,即不予给药处理。随后,在第30天和第60天时分别开始第二轮和第三轮的GC方案治疗,在治疗期间密切观察小鼠体重、小鼠精神状态等情况,关注化疗药物相关毒副反应。通过该种方法构建GC化疗耐药细胞系(T24 GC 3rd和5637 GC 3rd细胞)和化疗敏感UBC细胞系(T24和5637细胞)用于获得性耐药机制的研究。通过CCK-8实验进行验证细胞系的耐药生存能力。通过成球实验(Sphere formation)验证膀胱癌细胞细胞的干性富集能力。采用CD44标记的流式细胞仪检测干性标志蛋白CD44阳性细胞的数量。采用Western blot和RT-qPCR的方法验证相关基因的表达。在体外细胞和体内动物模型中评估miR34a/GOLPH3轴对UBC化疗耐药性和复发的调节作用,通过质粒转入上调和siRNA转入敲降相关基因的表达,观察肿瘤干性和耐药表型变化。采用荧光素酶检测(Luciferase assay)和点突变的方法研究miR34a直接转录后调控GOLPH3表达。并通过裸鼠皮下移植瘤实验进行验证miR34a/GOLPH3轴对GC方案化疗的治疗效果。此外,获取临床膀胱尿路上皮癌新鲜组织标本,在UBC标本中测定miR34a/GOLPH3轴和CSCs标志物的表达水平与膀胱癌耐药、复发的关系。并调取归档的、具有5年以上随访资料患者的膀胱癌石蜡组织切片和患者资料,采用免疫组化染色后,进行半定量的方法分析GOLPH3、CD44的表达与临床病理特征和预后的关系。结果:实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印记检测法(Westernblot)的结果证实GC耐药UBC细胞系中肿瘤干性Marker,如CD44、ALDH1A1、Sox2、KLF4和DNA损伤修复分子GOLPH3的表达显著上升。免疫组化(IHC)显示,耐药膀胱癌皮下移植瘤组织中肿瘤干性标志物CK5、CK14和CD44的表达在耐药膀胱癌组织中显著上升。此外,成球实验(Sphere formation)和流式细胞仪CD44阳性细胞检测实验显示肿瘤干性富集能力在耐药膀胱癌细胞中显著上升。并且发现膀胱癌干性富集能力和干性维持能力依赖于GOLPH3的表达,GOLPH3是已知的重要的DNA损伤修复分子,与肿瘤的化疗耐药相关。通过Home made PCR Array实验显示,miR34a在耐药膀肮癌组织和细胞中显著高表达,提示miR34a可能参与膀胱癌的化疗耐药。RT-qPCR结果显示耐药膀胱癌组织和细胞中miR34a表达水平下降,而GOLPH3的表达显著增加。荧光素酶实验(Luciferase experiment)证实GOLPH3是miR34a的靶基因,直接靶向GOLPH3的3’ UTR区,并且实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印记检测法(Westernblot)的结果证实miR34a的下调导致GOLPH3的表达显著增加。而miR34a的异常表达可以降低化疗耐药性UBC细胞的肿瘤干细胞(CSCs)样特性,并使这些细胞在体外和体内对GC化疗治疗重新致敏。采用裸鼠体内实验同样予以证实上述结果,即miR34a的异常表达可以降低化疗耐药性UBC细胞的肿瘤干细胞(CSCs)样特性,并使肿瘤重新对GC化疗治疗敏感。此外,miR34a/GOLPH3轴的表达水平与进行标准化GC方案化疗的膀肮癌患者的预后和复发具有明显的临床相关性。即miR34a表达高则GOLPH3的表达低,miR34a的表达与肿瘤干性能力(干性标志物CD44的表达水平)呈现显著正相关,GOLPH3的表达与患者GC化疗治疗后预后呈现负相关。结论:我们的研究结果表明,GC方案化疗能够促进膀胱癌的干性富集和化疗耐药。膀胱癌干性富集和化疗耐药作用依赖于GOLPH3的高水平表达。miR34a直接靶向GOLPH3的3’ UTR区转录后负调控GOLPH3的表达。因此,miR34a/GOLPH3轴在膀胱癌肿瘤干细胞(CSCs)富集中发挥关键作用,并影响UBC的化疗耐药性和随后的肿瘤复发。该miR34a/GOLPH3轴为UBC化疗耐药的关键靶点,有望成为治疗耐药UBC的有效方法。