目的:1.采用两阶段5/6肾切除小鼠模型探讨肾性骨病的病理机制;运用肾性骨病方及其有效组分特女贞苷早晚期干预,观察不同阶段用药对肾功能和骨代谢的影响;2.研究运用肾性骨病方有效组分特女贞苷在肾功能不全早期干预,是否能够通过调节相关micro RNA的表达,改善肾小管上皮细胞钙离子的存储和转运,从而改善肾功能,缓解肾功能不全导致的骨丢失。从而进一步揭示肾性骨病方的疗效机制。方法:一.5/6肾切除小鼠模型的建立及早晚期干预肾性骨病方的药效学观察1.建立慢性肾衰小鼠模型:选择3月龄C57B6J小鼠70只,采用两阶段5/6肾脏切除的方式,分为假手术0月组（基线）,假手术1月组,假手术2月组,假手术3月组,术后1月组,术后2月组和术后3月组,每组10只。术后取小鼠血清、L5椎体和肾脏组织,分别检测血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）,以评估肾脏功能;检测血磷（P）、血（Ca）及血清1,25（OH）2维生素D3（1,25（OH）2D3）和血清甲状旁腺激素（PTH）水平,评估代谢情况;micro CT扫描加重建L5椎体观察腰椎骨密度及椎体微结构;以上指标用于验证肾性骨病小鼠模型建立和确立用药时间;2.药效学观察:选择3月龄C57B6J小鼠80只,手术组给与两阶段5/6肾脏切除术,术后随机分为假手术组、模型组、阳性对照（罗盖全组）、肾性骨病方组,分别在术后1周和4周给予肾性骨病方及罗盖全灌胃,模型组及假手术组给与相同剂量生理盐水灌胃。各组给药8周,取小鼠血清,L5椎体和肾脏组织,分别检测CREA、BUN,以评估肾脏功能;肾脏Tunel染色观察肾脏细胞凋亡情况;马松染色观察肾脏病理结构及纤维化情况;检测血P、血Ca、血清1,25（OH）2D3和血清PTH,评估代谢情况;L5椎体进行阿尔辛兰/橙黄G染色观察骨组织形态;L5椎体micro CT扫描加三维重建观察腰椎骨密度及椎体微结构;免疫组化检测Osterix、Osteocalcin、Cathepsin K、MMP9评估成骨/破骨相关蛋白表达。二.肾性骨病方有效组分筛选及其对肾性骨病作用机制研究1.肾性骨病方有效组分体内药效学观察:选择3月龄C57B6J小鼠60只,两阶段5/6肾脏切除术后一周分别给与淫羊藿苷（20mg/kg）、女贞苷（20mg/kg）、特女贞苷（20mg/kg）及蛇床子素（20mg/kg）灌胃八周,取小鼠L5椎体和血清,分别检测血清CREA、BUN,以评估肾脏功能;检测血清Ca、血清P评估钙磷代谢情况;micro CT扫描加重建分析小鼠L5椎体骨密度情况。2.特女贞苷对5/6肾切除小鼠肾功能及骨密度作用机制研究:3月龄C57B6J小鼠80只,5/6肾脏切除术后随机分为假手术组、模型组、罗盖全组、特女贞苷组（40mg/kg）,分别于术后1周和4周给予特女贞苷以及罗盖全灌胃。各组给药8周,取小鼠L5椎体、血清和肾脏组织,分别检测CREA、BUN,评估肾功能;肾脏Tunel染色观察肾脏组织凋亡情况;马松染色观察肾脏结构及纤维化情况;检测血Ca、血P、血1,25（OH）2D3和血PTH水平,评估代谢情况;L5椎体行阿尔辛兰/橙黄G染色观察骨组织形态学变化;micro CT扫描加重建L5椎体观察腰椎骨密度及椎体微结构;免疫组化检测L5腰椎Osterix、Osteocalcin、Cathepsin K、MMP9评估成骨和破骨相关蛋白表达。三.肾性骨病方有效组分调节相关micro RNA改善肾功能的机制研究1.建立体外细胞钙离子超载模型:利用不同浓度离子霉素（Ionomycin）干预肾小管上皮细胞（HK2）,建立HK2细胞钙离子超载模型。Fluo-3AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度;流式细胞学检测细胞凋亡情况;Western blot检测Cam KII、Caspase3蛋白表达;2.miR3183对HK2钙离子超载诱导细胞凋亡的调节作用:利用RNAimax,在HK2中过表达miR3183 agomir及其对照miRNA agomir NC后,再给与Ionomycin干预24h、48h、72h。RT-q PCR检测各组miR3183表达水平;Fluo-3AM钙离子荧光探针检测细胞内钙离子含量;Western blot检测Camk II、Caspase 3蛋白的表达;流式细胞学检测细胞凋亡情况;3.特女贞苷（SPE）对miR3183及钙离子凋亡途径的调节作用:给与SPE干预后HK2细胞不同时间（24h、48h、72h）后,再给与Ionomycin处理细胞48h,RT-q PCR检测各组miR3183表达水平;Fluo-3AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度;Western blot检测Camk II、Caspase 3蛋白表达;流式细胞检测细胞凋亡情况。结果:一.早期应用肾性骨病方可以保护5/6肾切除术后小鼠肾功能,延缓骨丢失1.和假手术组相比,模型组小鼠术后肾功能出现明显下降,CREA、BUN显著升高;并出现高钙、高磷以及高甲状旁腺激素,低1,25（OH）2D3的情况。micro CT结果表明,5/6肾切除后模型组小鼠L5椎体松质骨骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和假手术组相比均明显下降,骨小梁分离度（Tb.Sp）显著升高;2.术后早期给与肾性骨病方干预后,和模型组小鼠相比,肾性骨病方组小鼠血CREA、BUN明显降低;血清Ca、血清P较模型组明显降低,血1,25（OH）2D3水平显著升高,血PTH水平下降但无统计学差异;而晚期干预对则小鼠以上指标无显著改善作用。肾脏马松染色显示早期给与肾性骨病方后,肾脏纤维化程度较模型组明显改善;小鼠肾脏Tunel染色结果显示肾性骨病方干预后,治疗组小鼠肾脏细胞凋亡情况较模型组明显下降。小鼠腰椎骨micro CT结果显示:和模型组相比早期应用肾性骨病方组后小鼠BV/TV、Tb.N显著升高,Tb.Sp明显下降,Tb.Th未见明显变化;免疫组化结果显示,和模型组小鼠相比,治疗组小鼠L5腰椎Osterix、Osteocalcin表达无明显变化,而Cathepsin K、MMP9表达明显降低;与之一致,TRAP染色显示早期应用肾性骨病方后,治疗组小鼠TRAP阳性数量明显低于模型组。二.特女贞苷早期应用可以保护5/6肾切除术后小鼠肾功能,延缓骨丢失1.给与肾性骨病方有效组分淫羊藿苷、女贞苷、特女贞苷和蛇床子素干预八周后,和模型组相比,女贞苷、特女贞苷组小鼠肾脏CREA、BUN明显下降;而且在给与特女贞苷干预后,与模型组小鼠相比,血Ca、血P均出现明显降低,具有显著统计学差异。micro CT结果显示:与模型组小鼠相比,淫羊藿苷、特女贞苷可以明显提高手术组小鼠BV/TV值;特女贞苷、蛇床子素可以提高手术小鼠Tb.N值,以上各组治疗后均未发现改善小鼠Tb.Th的作用;淫羊藿苷、女贞苷、特女贞苷及蛇床子素均可以明显降低小鼠Tb.Sp。2.早期应用特女贞苷后,治疗组小鼠CREA、BUN较模型组明显降低,血1,25（OH）2D3较模型组显著上升,血Ca、血P及血PTH明显下降;晚期治疗组小鼠血PTH、血P出现明显降低,余指标未见异常。肾脏马松染色显示早期治疗组小鼠肾脏纤维化程度较模型明显改善;肾脏的Tunel染色表明特女贞苷早期治疗可以显著降低5/6肾切除小鼠肾脏细胞凋亡。micro CT结果表明,与模型组相比,治疗组小鼠L5椎体BV/TV、Tb.N显著升高,Tb.Sp值明显降低,具有显著统计学差异,Tb.Th无明显改善作用;晚期干预特女贞苷对骨密度及骨结构无显著影响。免疫组化结果显示:和模型组小鼠相比,特女贞苷组小鼠L5腰椎Osterix、Osteocalcin表达明显升高,Cathepsin K、MMP9表达明显降低。与之一致,TRAP染色显示:早期应用特女贞苷后,治疗组小鼠TRAP染色阳性数量较模型组显著下降,而晚期应用后各组未发现明显变化。三.特女贞苷能够通过调节肾小管上皮细胞miR3183的表达,改善肾小管上皮细胞钙离子超载,降低细胞凋亡,保护肾功能。1.流式细胞学显示给与HK2细胞不同浓度Ionomycin后,在浓度为5ug/ml时,细胞内钙离子水平上升最明显,钙离子含量的升高随Ionomycin的用量成剂量依赖性;与之一致,细胞凋亡随着时间的推移在72h达到最高峰。PCR结果表明Ionomycin干预24h、48h和72h后,miR3183的表达明显降低;WB结果显示Ionomycin干预48h、72h后,Camk II、Caspase3蛋白表达开始明显升高。2.HK2细胞转染miR3183后,RT-q PCR结果显示miR3183在转染24h、48h、72h后,miR3183表达均显著升高。WB结果显示,转染miR3183 48h后Camk II、Caspase3蛋白表达明显降低,72h后蛋白表达量降低更为明显。流式细胞检学测细胞内钙离子含量发现转染miR3183 48h、72h后,Ionomycin诱导的HK2细胞内钙离子浓度较对照组明显下降。细胞凋亡结果显示,转染miR3183 24h、48h、72h后HK2细胞凋亡较对照组明显降低3.特女贞苷预处理HK2细胞24h、48h、72h后,再给与Ionomycin诱导细胞钙超载后发现,特女贞苷预处理后细胞内钙离子水平明显低于DMSO组,细胞凋亡情况较DMSO组也显著下降。PCR结果表明特女贞苷预处理24h、48h、72h后miR3183表达明显高于对照组。WB检测结果表明,特女贞苷干预24h以后未见明显蛋白表达的异常;但干预48、72h后,和DMSO组相比,Camk II、Caspase3蛋白表达明显降低。结论:1.早期应用肾性骨病方及其有效组分特女贞苷可以有效改善5/6肾切除小鼠肾脏功能,延缓骨丢失;2.特女贞苷可以通过促进肾小管上皮细胞miR3183的表达,抑制Camk II/Caspase3轴,降低肾脏细胞凋亡,保护肾功能。