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头颈部鳞形细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是人类常见的恶性肿瘤之一,其中喉癌占7.9%-35%。过去几十年里,尽管诊疗技术不断提高,喉癌的生存率仍然没有明显提高,这与肿瘤细胞的远处转移密切相关。区域淋巴结转移是致死性进程的主要原因之一,也是肿瘤预后主要指标和指导治疗的重要依据。许多学者致力于研究肿瘤侵袭、转移的分子学依据,期待能发现更精确更可靠的生物学标志。癌细胞对细胞外基质的黏附性降低是肿瘤细胞迁移、侵袭、转移的重要原因之一。粘着斑激酶(focal adhesion kinase ,FAK)是一个多功能的非受体酪氨酸激酶,它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中起关键作用。有学者研究证明,FAK与乳腺癌、直肠癌、甲状腺癌、肝癌、前列腺癌的侵袭及转移密切相关,而在头颈部肿瘤的研究甚少。本课题以头颈部常见恶性肿瘤喉癌为研究对象,利用免疫组化研究喉癌组织及细胞株中FAK的表达,再进一步研究利用RAN干扰(RNA interference)沉默FAK表达对喉癌Hep-2细胞株生物学行为的影响。实验共分两部分:第一部分FAK在喉癌组织及细胞株中的表达目的:本部分以喉癌组织及Hep-2细胞株为研究对象,采用免疫组化SP法及细胞免疫方法分别检测FAK在喉癌组织及细胞株中的表达,并研究其表达与患者临床病理特征之间的关系。方法:(1)随机抽取42例喉癌患者组织病理标本,以同期声带息肉组织标本作为对照。采用免疫组织化学法检测喉癌组织中FAK的表达,并结合患者的临床病理资料对结果进行统计分析。(2)常规培养喉癌Hep-2细胞株,采用免疫细胞化学法检测Hep-2细胞株中的FAK表达。结果:(1)喉癌组织中FAK的表达:喉癌组织中FAK的阳性表达率78.57%(33/42),对照组(声带息肉)中阳性率12.50%(5/40)( P<0.05);喉癌组织中FAK的表达与临床分期、颈部淋巴结转移比较差异有统计学意义(P<0.05),与病理学分级及临床分型比较差异无统计学意义(P>0.05) ;(2)喉癌Hep-2细胞株中FAK的表达为阳性。结论:喉癌组织中FAK表达与肿瘤侵袭及转移能力相关;喉癌Hep-2细胞株中FAK表达为阳性。第二部分RNAi沉默FAK表达对Hep-2细胞株增殖及侵袭能力的影响目的:构建在哺乳动物细胞中表达FAK的重组质粒FAK-pGenesil,并作用于Hep-2细胞株。探讨重组质粒对Hep-2细胞株FAK mRNA及蛋白的抑制作用,以及对Hep-2细胞株的增殖、侵袭能力的影响。方法:根据GenBank数据库提供的FAK基因核苷酸序列(基因号GI: 439874; ACCES2SION: L13616)设计的两条多聚核苷酸序列,构建两条干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1和FAK-pGenesil-CH2,并设计一条阴性对照重组质粒FAK-pGenesil-HK;在脂质体的介导下转染喉癌Hep-2细胞株,优化转染条件提高转染效率;用RT-PCR和Western Blot分析FAK mRNA及蛋白的表达;MTT法、流式细胞仪及体外侵袭实验,测定干扰重组质粒对Hep-2细胞株的的增殖、侵袭能力的影响。结果:(1)细胞转染条件的优化及细胞转染率的观察:当所构建重组质粒与脂质体的质量体积比为1:2.5转染时,转染效率最高达55%。(2)RT-PCR及Western blot的结果:干扰重组质粒FAKpGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2能使Hep-2细胞株中FAK mRNA及FAK蛋白的表达下调。FAK mRNA抑制率分别为71.54%、67.89%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);FAK蛋白抑制率达分别为41.74%、39.38%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)MTT法、流式细胞仪及体外侵袭实验结果: MTT显示干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用于Hep-2细胞株48小时后,细胞增殖抑制率分别为58.34%、52.78%,对照组为8.34%(P<0.05);流式细胞仪测定细胞周期显示,干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用于Hep-2细胞株48小时后细胞增殖率为25.28%、25.67% ,与对照组和正常组比较,差别有统计学意义(P<0.05);体外侵袭实验示,FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用Hep-2细胞株48小时后,Hep-2细胞穿过Matrigel膜的个数分别为56.0±6.7、51.0±5.1与对照组及正常组比较差别有统计学意义(P<0.05)。结论:构建两条干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2能有效地抑制转染Hep-2细胞株的FAK mRNA及FAK蛋白的表达,并能抑制Hep-2细胞株的增殖及侵袭能力。