目的：　　胶质瘤是中枢神经系统常见恶性肿瘤，而恶性程度最高的则是胶质母细胞瘤(GBM)。GBM侵袭性强，进展迅速，常浸润于正常脑组织中，手术难以全部切除，因此容易复发。目前治疗方式虽然结合了手术切除及术后联合放化疗，但患者平均生存期仍只有14个月，五年生存率约为10％。　　目前胶质瘤化疗最主要应用的化疗药物为替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)，理论上，特定DNA修复酶如O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)的存在，可以导致TMZ耐药，这使得替莫唑胺的应用遇到了瓶颈。因此寻找特异性强，可与现行化疗药物TMZ联合应用，对机体损伤小的抗肿瘤药物成为研究的新方向。　　由于胶质瘤对于机体自身免疫功能的抑制，以及瘤体本身免疫性质的改变，导致机体免疫系统难以对肿瘤组织产生杀伤作用，因此，寻找既能作用于肿瘤增殖和侵袭，又能调整肿瘤免疫学特性的新化疗药物是我们进一步研究的方向。　　全反式维甲酸(All-Trans Retinoic Acid，ATRA)是在临床治疗急性早幼粒细胞白血病的药物，属于促分化剂，对于细胞的分化以及凋亡均产生影响，对于机体免疫系统有调节作用，现已有研究显示ATRA对胶质瘤细胞也具有诱导分化以及抑制增殖的能力。　　锂剂(Lithium)广泛应用于精神疾病的药物，目前已知为GSK3-β抑制剂，GSK3参与了细胞增殖、分化、凋亡等过程，同时也参与了体内免疫细胞的分化，并于某些肿瘤中属于致癌基因。　　这两种制剂均可以通过NFAT1通路发挥作用。NFAT1为调节T细胞的重要因子，同时广泛存在于人体各个部位，NFAT1于胶质瘤中的高表达已在我们先前的实验中得到证实，因此本研究我们应用上述两种具有免疫调节功能的临床药物作为研究对象，探讨他们与替莫唑胺的联合效果，并验证联合应用时对于胶质瘤细胞增殖、侵袭力、凋亡、免疫表达是否有所影响，从而试图建立新的联合化疗方案。　　方法：　　一、细胞和细胞培养　　1、人脑胶质瘤细胞系U87-MG、U251-MG从中国科学院上海细胞库购得，并于中国医科大学基因组实验室培养，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37℃，100U/ml青霉素，1001μg/ml链霉素和5％CO2条件在恒温培养箱中培养。　　2、MTS法评估TMZ、ATRA与Lithium对脑胶质瘤细胞增殖的影响　　收集对数增长期的人胶质瘤U87-MG、U251-MG，调整细胞悬液浓度1×103个，接种到96孔板，5％CO2,37℃过夜，使细胞贴附至96孔板以后，加入含有Temozolomide(12.5、25、50、100μM), All Trans Retinoic Acid(1、10、30、50、100μM)，Lithium chloride(1、5、10、20 mM)和Control(2μl DMSO)的培养基200μl，设3个复孔。每孔加入20μl MTS试剂，继续培养4小时。终止培养，在酶联仪上震荡10秒后，OD490nm下测量各孔吸光值。　　3、Transwell法测定TMZ与Lithium对胶质瘤细胞侵袭力的影响　　在具有直径为8μm微孔基底膜的小室内预先铺好基质胶。5×104的U87胶质瘤细胞连同200μl的培养基(含0.2％FBS)置于上室，下室加入500μl的培养基(含20％FBS)。上室内加入Temozolomide(5、50、100μM)、Lithium chloride(5、20mM)以及Control(2μl DMSO)，5％CO2，37℃孵育24小时后，用棉签擦去上室的基质胶和细胞，PBS清洗一次，放入甲醇中固定1分钟，风干后苏木精染色3分钟，PBS清洗一次，伊红染色15秒，PBS清洗3次，风干后将基底膜切下，固定于盖玻片上，选择6个视野200高倍镜下计数，实验重复3次，进行统计学分析。　　4、RNA提取及Real Time PCR检测MHC分子、TGF-β、B7-H1的表达　　采用Trizol试剂一步法提取U251细胞总RNA。紫外分光光度计检测OD260/OD280及核酸浓度，使用两步法进行PCR扩增，比较处理以及未处理样品的目标转录本之间的表达差异　　5、流式细胞术观察细胞周期变化　　U251-MG细胞加入All-Trans Retinoic Acid（1、10μM），Lithium chloride(5、20mM)以及Control(2μl DMSO/200μl培养液)，培养24与72小时。上机检测前收集细胞、进行固定、PI染色。　　6、统计学分析　　所有统计学分析使用Windows SPSS19统计软件分析。组间比较使用t检验。P≤0.05认为有显著性差异。CellQuest software用于流式细胞仪的数据分析。　　结果：　　1、TMZ、ATRA与Lithium的应用可抑制胶质瘤细胞的增殖　　MTS结果表明，TMZ+Lithium组，ATRA+Lithium组在48与72小时内与对照组相比均有显著性差异。(P≤0.05)　　2、TMZ与Lithium对于胶质瘤细胞的侵袭性有抑制　　单独或是共同使用TMZ和Lithium，对于胶质瘤细胞系U87细胞与对照组相比，均有侵袭力降低，合并应用时，在TMZ低剂量组加入Lithium与单独应用TMZ的侵袭力抑制增加。（P≤0.05）　　3、MHC分子、TGF-β、B7-H1在应用ATRA与Lithium后表达的改变由于ATRA与Lithium对于NFAT1的调节互异，导致合用后MHC、TGF-β与B7-H1的表达量并无有意义的改变。MHC分子在单独应用Lithium或是ATRA高剂量时表达量降低;TGF-(a)在单独应用Lithium与ATRA时，并未出现有意义的表达量改变;而在B7-H1的表达量在单独应用Lithium时可见表达量增加，且成剂量依赖，但单独应用维甲酸时并未出现有意义的改变。　　4、应用ATRA与Lithium于U251细胞，未能产生细胞凋亡　　无论是单独使用Lithium，或是与ATRA合用，U251细胞系均未能产生凋亡，但是S期出现阻滞。(P≤0.05)　　结论：　　不论是单独或是共同应用ATRA以及Lithium，均可对胶质瘤细胞系U87、U251产生增殖抑制，TMZ与Lithium的联合应用也可增强TMZ的抑制增殖效果。由于ATRA与Lithium对于NFAT1的调控是反向的，在MHC、TGF-β、B7-H1的mRNA表达上，无法体现出有效的影响效果。在细胞周期中，U251细胞对于ATRA、Lithium单用或是联用均无法诱导出现细胞凋亡，却出现了S期细胞周期阻滞，考虑使用细胞系不同可能影响结果。TMZ与Lithium联合应用可以有效降低胶质瘤细胞U87的侵袭性，同时TMZ与ATRA或Lithium联合应用时均能提高肿瘤的免疫原性，减少免疫抑制因子的表达，这为未来临床与TMZ联合应用提供了理论基础。