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1.背景骨关节炎是关节炎中最常见的一种类型,是一种以关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为表现的慢性关节疾病,多见于中老年人群。骨关节炎可发病于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱以及指间关节等部位。骨关节炎通常分为原发性和继发性两大类。继发性骨关节炎通常由先天性畸形、创伤、关节不稳定等原因导致关节局部在病变的基础上发生骨关节炎。而原发性骨关节炎并没有明确发病原因,多见于50岁以上的中老年人。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β 1是一种重要的细胞因子,可激活体内多种信号转导通路对细胞功能进行调控,其中以TGF-β1/Smads通路最为重要。TGF-β 1与细胞表面Ⅰ、Ⅱ型受体复合物(TGF-β R)结合,活化的Ⅰ型受体与胞浆中Smad-2/3结合,使之磷酸化而激活,再通过Smad-4将信号传递至细胞核,活化核转录因子,调控靶基因的表达。上述过程中,TGF-β R起着的非常重要的作用,直接影响到该信号通路发挥后续的一系列生物学效应。TGF-β R有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种形式,分子量分别为53kDa、70～85kDa和250～350kDa。Ⅰ和Ⅱ型TGF-β R为糖蛋白,它们与TGF-β 1的亲和力较与TGF-β 2的亲和力大10～80倍;Ⅲ型受体为蛋白聚糖(proteoglycan),它与TGF-β1、TGF-β 2、TGF-β 3的亲和力近似。TGF-β 1/Smads通过正负反馈调节环路实现自我调控,一方面TGF-β 1通过Smads激活核内TGF-β 1启动子,自我诱导内源性TGF-β 1表达,使细胞自分泌TGF-β 1,并上调Ⅰ、Ⅱ型受体的表达,通过Smads通路放大信号,形成正反馈环路;另一方面TGF-β 1还通过Smads激活核内Smad-7启动子,瞬时上调Smad-7表达,Smad-7竞争性结合活化的Ⅰ型受体,通过阻止Smad-2/3磷酸化抑制TGF-β 1的信号转导,形成负反馈环路。有报道显示TGF-β 1/Smad信号通路在原发性骨关节炎的发病过程中起到了重要的作用。二磷酸腺苷核糖多聚酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶,他参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方式之一。PARP-1具有几个重要的结构域,其能够被一些如胱天蛋白酶,钙蛋白酶,组织蛋白酶,颗粒酶和MMPs等蛋白酶切割,导致介导细胞死亡的结构域暴露使细胞发生凋亡和损伤后的修复,是细胞损伤后的一个重要感受器。此外,PARP-1能够参与蛋白质的翻译调控,有研究发现,PARP-1参与了 TGF-β 1信号通路的调控包括Smad介导的转录和TGF-β的表达。研究表明PARP-1与TGF-β 1/Smad信号通路之间有着密切的关系,但由于TGF-β1/Smad信号通路的复杂性,PARP-1对其的作用机制也较为复杂,目前尚无定论。2.目的2.1探讨PARP-1在原发性骨性关节炎软骨细胞中的表达,以及PARP-1的表达水平与原发性骨性关节炎发病程度的相关性。2.2通过体外细胞实验,探讨在软骨细胞中PARP-1介导的TGF-β 1/Smad信号通路在原发性骨性关节炎中的分子机制。2.3通过体内实验,探讨靶向抑制PARP-1介导的TGF-β 1/Smad信号通路在治疗原发性骨性关节炎中的有效性。3.材料和方法3.1载体的构建3.1.1 PCR反应根据目的片段序列设计特异性引物序列,以cDNA为模板,经PCR放大得到目的片段。遵循普通PCR反应条件,其中,退火温度及延伸时间根据引物长度和目的片段大小而调整。普通Taq PCR酶的扩增速度为1kb/min。3.1.2琼脂糖凝胶电泳凝胶浓度、凝胶大小依DNA样品序列长短和样品多少而定,电泳时间长短可根据样品序列长短和凝胶的浓度调整。3.1.3酶切及连接实验中所使用的表达质粒为pGL3和pcDNA3.1-eGFP。将所需序列进行PCR扩增后,前者经BamHI、KpnI双酶切,后者经XbaI、EcoRI双酶切。再由T4 DNA连接酶克隆至相同处理的质粒中。3.1.4质粒转化及小提质粒按操作程序进行转化扩增,质粒小提使用质粒小提试剂盒。3.2小鼠原代膝关节软骨细胞提取和培养对关节软骨细胞按严格操作程序进行提取、传代、冻存、转染。3.3 RNA的提取总RNA样品提取使用Trizol法。3.4反转录将RNA反转录成为cDNA,作为PCR的模板。3.5实时定量PCRRT-PCR使用 SYBR Green qPCR Superrmix Real-time PCR 试剂盒,在 Real-time PCR仪上完成。3.6免疫印迹实验按照细胞裂解、SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、成像等程序操作。3.7免疫共沉淀实验免疫沉淀反应后,在4℃以3,000 rpm速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3～4次;最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液,沸水煮5分钟;Western blotting分析。3.8小鼠膝骨关节炎模型的建立本课题所采用的膝骨关节炎模型为小鼠内侧半月板不稳定模型。3.9小鼠膝关节取材取完整膝关节标本,固定24小时后可进入脱钙程序。标本清洗后,进行脱水和透明处理,浸蜡和包埋后标本切片。3.10小鼠膝关节标本石蜡切片蕃红固绿染色石蜡切片脱蜡和复水后,石蜡切片蕃红固绿染色。3.11小鼠膝关节标本石蜡切片免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡和复水,免疫组织化学染色。3.12免疫组织化学染色小鼠的关节软骨损伤组织学评估参考OARSI(Osteoarthrisits Research Society International)推荐方法。处死小鼠后,取下小鼠膝关节,按照上述方法固定和脱钙,然后石蜡包埋。切片时呈矢状位从关节外侧向内切片,每个标本的切片要连续并横跨整个关节。每张切片厚度为5μm,连续切片切10张后,在10张切片中选3张切片捞在1张载玻片上,每个标本共捞十张左右载玻片后蕃红固绿染色以供软骨损伤评分用,中间的切片可捞在载玻片上供免疫组化使用。4.结果4.1原发性膝骨关节炎中PARP-1水平升高小鼠原发性膝骨关节炎的程度随着鼠龄的增长而加重;PARP-1与原发性膝骨关节炎的病变程度正相关;创伤性膝骨关节炎中PAPR-1表达不变。4.2原发性膝骨关节炎中TGF-β 1/Smad信号通路的表达原发性膝骨关节炎中p-Smad2/3的活性降低;原发性膝骨关节炎中p-Smadl/5/8的活性升高。4.3 PARP-1对TGF-β 1/Smad信号通路的影响和分子机制4.3.1 siRNA抑制软骨细胞中PARP-1的表达靶向性的siRNA显著的抑制了 PARP-1的转录和翻译水平,降低了其在软骨细胞中的含量。4.3.2 PARP-1的下降导致TGF-β1/Smad信号通路的变化相比于对照组,当软骨细胞同时转染了 PARP-1的siRNA之后,p-Smad2/3的表达水平显著上升。而通过检测Smad2/3活性的pGL3-(CAGA)12-Luc质粒的表达可以发现,当PARP-1表达量下调后,Smad2/3对下游靶基因的调控作用会升高,而与之相反的是,p-Smad1/5/8的表达水平会随着PARP-1的降低而降低。4.3.3 PARP-1的下降导致Collagen Ⅱ和PAI-1的表达变化当PARP-1的表达被抑制后,软骨细胞中的Collagen Ⅱ和PAI-1的mRNA和蛋白表达量均显著提高。4.3.4 PARP-1的下降导致Smad2/3复合体多聚化的抑制当PARP-1表达量降低时,通过PAC抗体沉淀出的Smad2/3蛋白含量降低,表明Smad2和Smad3的二磷酸腺苷核糖多聚化程度降低,与之前的报道结果一致。4.4 PARP-1在小鼠体内对原发性膝骨关节炎的作用4.4.1 PARP-1抑制剂对软骨细胞中PARP-1和MMP-13的表达影响小鼠接受PARP-1抑制剂后,PARP-1的表达量无显著差异,MMP-13的表达量显著下降。而对石蜡切片的免疫组化染色结果也表明注射抑制剂后,PARP-1的表达量无显著差异,MMP-13在膝关节组织中的表达量相对于对照组显著降低。4.4.2 PARP-1抑制剂导致TGF-β 1/Smad信号通路的变化小鼠接受PARP-1抑制剂后,Smad2和Smad3的活性升高,软骨细胞中p-Smad2/3的表达水平上升;而与之相反的是,p-Smad1/5/8的表达水平显著降低。4.4.3 PARP-1抑制剂对细胞外基质相关蛋白的表达水平的影响当PARP-1的表达被抑制后,软骨细胞中的Collagen Ⅱ和PAI-1的mRNA和蛋白表达均显著提高。4.4.4 PARP-1抑制剂缓解骨性关节炎病变程度为了评估膝骨关节炎的病变情况,我们对组织切片进行了蕃红固绿染色,并使用OARSI评分标准来进行评估。结果显示,在接受PARP-1抑制剂治疗的膝关节组织中,关节炎的病变程度明显降低,说明该治疗方法对缓解膝骨关节炎有显著的效果。5.讨论研究表明,PARP-1在原发性骨关节炎的发病和发展过程中起到了重要的作用。PARP-1的含量与原发性骨关节炎病变程度正相关。PARP-1可以通过与TGF-β 1/Smad信号通路的相互作用调控其下游基因的表达,同时PARP-1也可以直接作用于Smad2/3的复合体,影响其对靶基因表达的调控。在细胞水平上,抑制PARP-1的表达后,可以检测到p-Smad2/3的表达升高,以及p-Smad1/5/8的表达降低。而在小鼠实验中,通过注射PARP-1抑制剂来可降低膝骨关节中MMP-13的表达,p-Smad2/3的表达水平显著上升,p-Smad1/5/8的表达水平显著降低。与此同时,Collagen Ⅱ和PAI-1的mRNA和蛋白表达量均显著提高。通过免疫组化证实,注射PARP-1抑制剂PARP-1表达的无显著变化,而MMP-13表达量显著降低。同时,运用OARSI关节炎诊断标准,也证实了注射PARP-1的抑制剂可以有效缓解原发性膝骨关节炎的发展。