论文部分内容阅读
目的:1)探讨手术是否导致小鼠的情景记忆的障碍,并采用腹腔注射Gal的干预方法,评价对小鼠情景记忆产生的影响;2)探讨手术导致的PND模型中小鼠海马区不同细胞、受体、突触功能在分子生物学及电生理学变化的特点;3)评价Gal对手术组小鼠海马区不同细胞在分子生物学及电生理学变化的影响。方法:1)选取10-12个月雄性C57/BL6野生型小鼠。手术前对小鼠完成恐惧条件实验中的环境恐惧训练,手术组麻醉下行单侧胫骨骨折后并采用髓内钉内固定术,假手术组只进行麻醉。对两组小鼠体内分别使用Gal（4mg/kg）或生理盐水每天一次腹腔注射,术后第3天及第7天评价两组小鼠的情景记忆能力。同时用开场试验及爬杆试验评价小鼠运动能力,用以判断行手术的小鼠与假手术组之间是否会因为腿部手术造成运动能力上的差异。使用SigmaPlot 11.0或GraphPad Prism 7.0绘制图表并进行统计分析,数据以均数±标准误表示。对于两组数据之间的比较,采用双尾t检验,多组之间的比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。P＜0.05被认为具有统计学意义;2)小鼠按假手术组及手术组随机分为2组,术后第3天,按实验操作规范提取小鼠海马组织,使用共焦显微镜对切片小胶质细胞（Iba-1染色）和星形胶质细胞（GFAP染色）进行观察成像与计数。使用ELISA法测量海马中的促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）和抗炎细胞因子（IL-4和IL-10）。通过腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉小鼠后,使用小鼠头部立体定位框架固定小鼠以50 nl/min的速度注射携带ACh传感器的病毒载体（AAV-hSyn-GACh3.0）至背侧海马。三周后,制备急性300μm厚海马切片进行实验,用荧光显微镜观察海马CA1区对来自O/A区电刺激的GACh荧光成像。在含碳ACSF中用SR101与Fluo-4 AM染色海马切片星形胶质细胞,用红色荧光照明观察SR101标记的星形胶质细胞,绿色荧光照明观察Fluo-4 AM显示的钙信号。观察并记录在来自O/A区电刺激诱发CA1区星形胶质细胞中的钙浓度变化引起荧光强度的变化（ΔF）。使用急性海马脑片将刺激电极安置在Schaffer侧支并远离记录电极400-500 μm距离,使用细胞膜片钳技术记录来自CA1区海马神经元,星形胶质细胞及fEPSPs的电生理信号;3)在手术组及假手术组小鼠体内分别使用Gal（4mg/kg）或生理盐水每天一次腹腔注射,术后第3天按实验操作规范提取小鼠海马组织,使用共焦显微镜对小胶质细胞（Iba-1染色）和星形胶质细胞（GFAP染色）进行观察成像与计数。使用ELISA法测量海马中的促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）和抗炎细胞因子（IL-4和IL-10）。海马急性脑片使用红色荧光剂SR101及绿色荧光剂Fluo-4标记星形胶质细胞,并使用浓度10μM的Gal灌浴,观察用电刺激-诱发钙信号荧光强度的变化（ΔF）。对背侧海马含有ACh传感器的病毒载体（AAV-hSyn-GACh3.0）的海马急性脑片使用Gal进行灌浴,用荧光显微镜对海马CA1区的GACh信号进行成像收集数据。使用Gal（10μM）或FC（100μM）进行灌浴,将刺激电极安置在Schaffer侧支并远离记录电极400-500μm,使用膜片钳技术记录来自CA1区星形胶质细胞,海马神经元及fEPSPs或的电生理信号。结果:1)在恐惧训练前,假手术组小鼠和手术组小鼠之间姿势冻结时间占比没有显著差异。训练后3天和7天,与基线水平相比,假手术组小鼠和手术组小鼠的冻结时间增加（P＜0.01）,手术组小鼠的冻结时间明显小于假手术组小鼠（P＜0.05）,两组小鼠在开放场测试和爬杆试验及Gal干预后的运动能力差异没有统计学意义（P＞0.05）。手术组小鼠在Gal干预后,与生理盐水组对比,冻结时间占比明显延长（P＜0.05）;2)对两组小鼠中的海马进行免疫组织化学检测,手术组小胶质细胞数量较假手术组显著增加约2倍（P＜0.01）,没有区域特异性。星形胶质细胞密度、总GFAP免疫反应面积均增加（P＜0.01）。手术组小鼠海马中促炎细胞因子IL-1β（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.01）和IL-6（P＜0.05）升高。在两组小鼠海马中抗炎细胞因子（IL-4和IL-10）的含量在统计学上没有差异（P＞0.05）。手术组小鼠海马星形胶质细胞静息膜电位（P＜0.01）、电导（P＜0.01）及电容（P＜0.05）与假手术组相比均增加。手术组小鼠锥体神经元AMPA受体介导的的EPSCs和fEPSPs显著降低（P＜0.01）,但是整流指数无统计学差异。在急性海马切片中电刺激释放乙酰胆碱的峰值反应、电刺激诱发星形胶质细胞峰值反应值手术组小鼠明显低于假手术组（P＜0.01）。非选择性毒蕈碱受体拮抗剂东莨菪碱（Scop,5μM）显著的地抑制O/A区诱发的钙升高,两组小鼠分别抑制73.75%±7.07%和76.25±3.85%;3)手术后第3天,小胶质细胞激活数量假手术组+生理盐水比手术组+Gal小（P＜0.05）,手术组+生理盐水比手术+Gal增高（P＜0.05）。手术+Gal组中海马IL-1β、TNF-α、IL-6中均表现出比手术+生理盐水中降低,有统计学差异。IL-4和IL-10各组之间无显著性差异。术后第3天的海马急性脑片中,使用Gal灌浴后,手术组海马中AMPA受体介导的EPSCs的变化幅度大于假手术组（P＜0.05）。手术组海马CA1区星形胶质细胞中电刺激-诱发荧光强度的变化程度大于假手术组（P＜0.01）。使用Gal或FC灌浴后,手术组与假手术组相对于基线水平fEPSP振幅均显著增大（P＜0.01）。手术组小鼠中fEPSP振幅达到与假手术组未使用Gal灌浴时的水平（P＞0.05）。结论:1)Gal干预可改善手术导致的小鼠情景记忆障碍;2)手术本身可以导致小鼠海马区胆碱能神经功能抑制,免疫细胞的激活,引起小鼠中枢海马区炎性细胞因子升高,表现为海马区免疫细胞及神经元功能障碍和突触可塑性降低;3)通过腹腔注射Gal的干预,可以减轻手术组小鼠海马中的炎性反应及抑制免疫细胞的激活状态。加兰他敏可以恢复手术引起海马区的免疫细胞及神经元的功能异常,通过在海马脑片Gal及FC的灌浴,可以恢复手术引起海马区的突触可塑性的降低。综上所述,加强小鼠中枢胆碱能功能和/或减轻炎性反应,可能是改善PND症状潜在的靶点及策略。