骨肉瘤是最常见的恶性骨原发肿瘤,好发于青少年。骨肉瘤恶性程度高,易复发且早期转移率高,其治疗是骨肿瘤专业最具挑战性的课题之一。初诊骨肉瘤患者中,约有10%-20%会出现远处转移,其中肺转移约占90%,即骨肉瘤肺转移具有明显器官特异性,骨肉瘤一旦发生转移,提示预后不良,肺转移患者5年整体生存率为20%-30%。骨肉瘤患者生存率近30年来未取得突破性的进展,分析其主要原因是骨肉瘤患者肺转移的出现及肺转移的难治性。因此,降低肺转移的发生,寻找肺转移相关分子标志是亟待解决的关键问题。整合素是一种连接细胞和其外环境的跨膜受体,表达于体内大多数细胞表面,通过识别纤粘蛋白/胶原蛋白和层粘蛋白等多种细胞外基质分子,参与细胞黏附,运动,侵袭转移等多种生命活动。前期预实验结果显示,外周血整合素β4水平在骨肉瘤肺转移患者较非肺转移呈现升高趋势,但尚未得出统计学差异,是否可以通过提高检测手段的敏感性发现二者的相关性成为需要解决的关键问题。外泌体是直径约30-100nm的纳米微囊结构,一般由活细胞所分泌,广泛分布于血清、尿液、唾液等体液中,它富集了来源细胞所包含的多种信息,在肿瘤进展和转移中发挥至关重要的作用。据研究报道,肿瘤外泌体整合素决定了肿瘤转移的器官特异性,其中整合素β4在肿瘤肺转移中起着至关重要的作用,其表达水平的高低可以用来预测肺转移。而骨肉瘤细胞来源的外泌体也包含有多种物质,在骨肉瘤微环境的调节中起着重要作用。因此,我们提出设想,外泌体整合素β4是否可以预测骨肉瘤肺转移呢,是否可以提高血清中整合素β4的检测手段的敏感性明确二者相关性,进而为骨肉瘤肺转移的诊断提供依据呢?综上所述,为研究外泌体整合素β4是否在骨肉瘤肺转移中起着至关重要的作用及相关作用机制,进行了下面的研究,以期能找到骨肉瘤肺转移的分子标志物,从而更好的为临床提供理论依据。研究方法和结果:1.临床数据分析及外周血整合素β4和外泌体整合素β4检测(1)临床数据分析收集陕西省西安市空军军医大学(原第四军医大学)第一附属医院自2014年1月-2017年5月期间住院的82例骨肉瘤患者,其中男性48例,女性34例,年龄9-54岁,中位年龄17岁。预后分析显示:对患者生存率的影响因素有分期、肺转移数目、肺转移治疗方式;其中肿瘤分期、肺转移治疗方式为影响生存的独立预后因素。(2)外周血整合素β4和外泌体整合素β4检测研究应用ELISA方法检测骨肉瘤患者与正常人血清中及血清外泌体中整合素β4水平,结果显示,整合素β4及外泌体整合素β4在骨肉瘤患者中水平明显高于正常人群;进一步分析骨肉瘤患者血清整合素β4,结果显示肺转移患者血清整合素β4水平高于无肺转移者,但未显示出统计学差异(P>0.05);而且,骨肉瘤患者血清外泌体整合素β4水平明显高于血清整合素β4水平。利用超高速梯度离心法对骨肉瘤患者(分为骨肉瘤术前,术后无肺转移,术后肺转移三组)血清中外泌体进行提取和分离,进而应用透射电镜对外泌体的形态及大小进行鉴定,同时应用流式细胞术鉴定外泌体特征性分子标志CD63、CD81的存在,分别应用流式细胞术和Western-Blot方法检测了三组患者血清外泌体整合素β4水平,结果显示,术后肺转移组>术前>术后无肺转移组,提示外泌体整合素β4与骨肉瘤肺转移相关。患者资料分析显示:外泌体整合素β4与骨肉瘤患者分期相关(P=0.01),与是否有肺转移相关(P=0.0018),与肺转移大小相关(p=0.0076),与患者性别、肿瘤部位、原发肿瘤大小、是否行术前新辅助化疗及新辅助化疗疗效无明显相关性。2.分析外泌体整合素β4在骨肉瘤细胞中的生物学功能:(1)构建整合素β4干涉表达及过表达慢病毒载体感染骨肉瘤细胞MG-63,筛选出稳定转染的细胞株,然后应用Western-Blot和RT-PCR鉴定慢病毒转染后外泌体整合素β4蛋白和mRNA在细胞中的表达情况。(2)细胞迁移及侵袭力检测我们采用划痕实验及Transwell实验检测了对照组,外泌体整合素β4过表达组及外泌体整合素β4干涉表达组间细胞迁移能力及侵袭能力的变化。结果显示,与对照组相比,外泌体整合素β4过表达后,细胞迁移和侵袭力增强。(3)转移相关蛋白表达检测应用Western-Blot方法检测了对照组,外泌体整合素β4过表达组及外泌体整合素β4干涉表达组间MMP-2、MMP-9蛋白表达变化情况,结果显示,与对照组相比,外泌体整合素β4增强了MMP-2、MMP-9蛋白表达,而干涉外泌体整合素β4则降低了MMP-2、MMP-9蛋白表达水平。(4)建立荷瘤鼠模型分别收集对照组和干涉整合素β4两组细胞上清,将其经尾静脉注入裸鼠体内,检测荷瘤鼠肺转移病灶数目,同时应用HE染色及免疫组化等实验技术观察骨肉瘤细胞在裸鼠体内侵袭力及MMP-2、MMP-9蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,干涉整合素β4表达后降低了骨肉瘤细胞的侵袭转移能力,肺转移数目较对照组减少,而且MMP-2、MMP-9蛋白表达降低。3.外泌体整合素β4在骨肉瘤肺转移中的分子机制探索:(1)我们使用Western-blot方法检测P38MAPK、ERK1/2、JNK总蛋白和它们的磷酸化水平的表达情况,来探索整合素β4在骨肉瘤细胞侵袭转移中的相关分子机制。具体结果表明,p38MAPK在整合素β4过表达组未见明显变化,JNK表达水平不随整合素β4过表达而变化,ERK1/2总蛋白及磷酸化水平表达在整合素β4过表达组较对照组增加。该研究结果提示,整合素β4增强了骨肉瘤MG63细胞中ERK1/2的表达。与此相反,干涉表达整合素β4后JNK/p38MAPK水平较对照组均未见明显变化,而ERK1/2总蛋白及磷酸化水平均较对照组减低。(2)为证实上述所得结果,我们进一步应用ERK1/2的抑制剂PD98059(10umol/ml),p38MAPK的抑制剂SB203580(10umol/ml)和JNK的抑制剂SP600125(50umol/ml)分别处理整合素β4过表达的MG63细胞各1h,结果显示,过表达整合素β4后显著增强了MG63细胞的侵袭能力,整合素β4过表达组的细胞经ERK1/2抑制处理后可以使MMP-2、MMP-2水平降低;而整合素β4过表达组的细胞经过SB203580和SP600125处理后的细胞侵袭能力则未发现明显变化。该研究结果表明,由整合素β4所介导的骨肉瘤细胞的侵袭转移能力是通过调节ERK1/2信号通路实现的。结论:1.骨肉瘤患者真实世界的数据分析显示骨肉瘤肺转移发生率高,且肺转移严重影响生存;单因素分析显示,影响预后的因素包括分期,肺转移灶数目以及肺转移的治疗方式;进一步多因素分析,结果显示,分期和肺转移的治疗方法是影响骨肉瘤患者预后的独立因素。2.外泌体整合素β4在骨肉瘤肺转移中具有重要作用,外泌体整合素β4与骨肉瘤患者分期相关,与是否有肺转移相关,与肺转移大小相关,与患者性别、肿瘤部位、原发肿瘤大小、是否行术前新辅助化疗及新辅助化疗疗效无明显相关性,且血清外泌体整合素β4水平与骨肉瘤肺转移呈正相关,对骨肉瘤肺转移起到一定的指导作用;3.在外泌体整合素β4参与的骨肉瘤细胞转移过程中,是通过调节ERK1/2的信号通路所实现的。