沙门菌属(Salmonella)是研究较为广泛的病原菌属之一，其基因组结构及近百分之六十的基因功能已被阐明，已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌。伤寒沙门菌(S.entericaserovar Typhi)和鼠伤寒沙门菌(S.enterica serovar Typhimurium)是肠炎沙门菌(S.enterica)中最为重要的两个致病性血清型，由于伤寒沙门菌是一种人类致病菌，无法实施有关感染和毒力学方面的活体实验，故至今，有关伤寒沙门菌的认识大多来自于在鼠体内引起类似伤寒热的鼠伤寒沙门菌的研究。　　 基因芯片技术的发展为全面、高效观察基因表达提供了一个极佳的策略。运用全基因组芯片技术对原核生物基因表达谱分析已有许多报道，如基因表达谱分析，细胞分型，致病性分析，比较基因组学研究，药物研发，肿瘤研究，疫苗的研发，及单核苷酸多态性分析等。目前，已有数百种微生物完成了全基因组序列测定，为全基因组DNA芯片的研制提供了丰富的基因序列信息，同时也为该技术在微生物研究中的应用提供了广阔的空间。　　 Stanford大学的研究人员在2003年首先建立了沙门菌基因组芯片，极大推动了有关基因表达谱和比较基因组学研究，由于西方发达国家鼠伤寒沙门菌感染较多，沙门菌基因组芯片应用研究多集中于鼠伤寒沙门菌的研究。基因芯片原位合成制备技术诞生后，虽有多家公司相继设计生产出各种Oligo基因组芯片，但目前价格仍然十分昂贵，在我国大规模应用仍受到一定限制。　　 另外，目前DNA芯片基因表达谱研究的报道，多集中于真核生物，这是由于真核生物mRNA具有polyA尾，易于获得。原核生物的基因表达谱研究也有报道，但因其mRNA无poly(A)序列等基本特征，只能通过提取总RNA的方式进行相关实验，至今没有一个统一的操作方法。　　 伤寒沙门菌在感染人体的整个过程中，要遭遇多种不同的剧烈的环境胁迫，如胃部强酸，肠道的高渗和胆汁，网状内皮细胞的高氧等。伤寒沙门菌必须启动相应的信号转导通路来对付这些不利的环境变化，从而得以在人体内生存并感染宿主细胞。原核生物中的信号转导通路通常由细胞膜上许多特殊的感受分子(sensor)与胞内的效应调节分子(response regulator)相偶联构成的双组分调节系统(two-component regulatory system)所介导。　　 UhpB/UhpA是其中的一种非典型性双组份调节系统，由细胞外葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)启动，与分解代谢基因激活蛋白一起，激活uhpT的转录。迄今为止，G-6-P被认为是激活UhpABC信号通路的唯一配体。意味着，到目前为止，UhpABC的已知功能仅在于帮助肠道菌利用G-6-P作为碳源和能源物质。但是，本室前期基于DNA芯片的研究工作中，发现高渗应激15分钟后，野生型伤寒沙门菌的uhpA和uhpB基因均有所上调。据此推测，在高渗应激下uhpA可能有未被认知的功能。　　 目的：　　 1.制备伤寒沙门菌基因组DNA芯片，为低消耗、大规模地开展相关的基因表达谱分析和比较基因组学研究提供了一个关健技术平台；　　 2.建立和优化伤寒沙门菌基因组DNA芯片基因表达谱分析技术；　　 3.敲除伤寒沙门菌uhpA基因获得uhpA基因缺陷变异株；　　 4.运用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片基因表达谱分析技术来比较野生型伤寒沙门菌与uhpA基因缺陷变异株基因表达谱的差异以期获得UhpA的潜在功能。　　 方法：　　 1.伤寒沙门菌基因组DNA芯片的制备：利用伤寒沙门菌现有的全基因组序列，以Ty2菌株的基因组为基准，选取CT18菌株和z66阳性菌株的特异性的蛋白编码基因，设计特异性引物，经PCR扩增，有效扩增产物纯化后点样于多聚赖氨酸玻片制备伤寒沙门菌基因组DNA芯片，并验证芯片样点位次与效果；　　 2.伤寒沙门菌基因组DNA芯片基因表达谱分析技术的建立与优化：本研究主要从RNA的提取、反应体系、RNA用量、反转录酶用量、不同的引物及用量、荧光素用量、cDNA标记及纯化方法、杂交温度及时间等方面对细菌基因表达谱条件进行优化。提取伤寒沙门菌野生z66阳性菌株总RNA，以六、九核苷酸随机引物(N6、N9)和(或)基因组特异引物(GDP)反转录合成cDNA，用荧光素Cy5或Cy3直接掺入标记后，与伤寒沙门菌全基因组芯片杂交，用芯片扫描仪扫描后经过数据标准化处理后及统计分析，获得表达谱分析结果。　　 3.伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株制备：采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌调节因子UhpA的基因缺陷变异株，根据伤寒沙门菌uhpA基因序列设计引物，扩增uhpA基因上、下游同源性片段，定向连接成uhpA基因缺损型同源核苷酸片段，并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株，在5％蔗糖LB平板上培养，诱导重组，通过筛选获得完全重组的uhpA基因缺陷变异株；　　 4.伤寒沙门菌基因转录表达谱分析：利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，体外模拟高渗环境应激，在低渗(50mmol/L NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株4h(37℃，250rpm)至对数生长期，后转入高渗(300mmol/L NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养，在高渗应激早期(30min)，分别提取伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株的总RNA，反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5)，与基因组芯片杂交，扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平，比较伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异；　　 5.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析：选择部分表达差异显著的基因，设计并合成特异性引物，进行实时荧光定量PCR，验证DNA芯片分析结果。　　 结果：　　 1.成功扩增出伤寒沙门菌4201个蛋白编码基因，芯片样点位次验证结果显示点样位点正确，杂交效果良好，表明伤寒沙门菌基因组DNA芯片制备成功；　　 2.采用N9+GDP混合引物，直接掺入法标记时，既能获得较好标记效果，又能节约试剂成本，同时减少繁琐步骤所引起的不必要失误；　　 3.PCR及序列分析证实，uhpA基因缺陷变异株中uhpA基因315bp被6bp取代，表明成功构建uhpA基因缺陷变异株；　　 4.基因表达谱比较分析结果表明，与野生株相比，伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株在高渗应激30分钟，有21个基因显示出明显的表达差异，且全部明显下调(2倍以上)。其中，参与调节半胱氨酸合成途径无机硫酸盐同化作用的相关基因全部下调，如cysJ，cysD，cysP，cysW，cysU，cysA，cysC，cysK，cysH，cysN，cysI，cysM等；　　 5.实时荧光定量RT-PCR验证结果显示，与基于DNA芯片的基因表达谱分析数据相比，两者变化情况一致，相互吻合。　　 结论：　　 1.成功制备了伤寒沙门菌基因组DNA芯片，为有关伤寒沙门菌基因表达调控及致病性机理，进化和基因多样性等方面的深入研究提供有效的技术支持；　　 2.设计了基因表达谱用GDP引物，从而提高了表达谱分析的灵敏度和特异性，成功构建了基于伤寒沙门菌基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术，为大规模的功能基因组研究提供了一个高效的技术平台；　　 3.成功构建伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株，可用于下游基因表达调控网络的分析；　　 4.伤寒沙门菌UhpA参与高渗应激后调节半胱氨酸合成途径无机硫酸盐的同化作用，拓宽了我们对于伤寒沙门菌基因表达调控网络的认识；　　 5.实时荧光定量PCR验证了基因芯片实验的部分结果，说明本研究构建的基于伤寒沙门菌全基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术较为成熟，研究发现的UhpA作用可信。