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目的:非小细胞肺癌死亡率位于常见恶性肿瘤的首位。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）在恶性肿瘤侵袭与转移、放化疗耐受等过程中的作用举足轻重,揭示EMT的发生机制对于肺癌的诊断治疗及预后等具有重要意义。MiRNA（miRNA）是一类广泛存在于真核细胞中的内源性非编码单链小分子RNA,具有高度的稳定性,常作为肿瘤诊断、预后及耐药等的重要标记分子。本研究在前期工作基础上,以转化生长因子β（TGF-β）长期处理非小细胞肺癌细胞株H358所获得的EMT细胞（H358-TGF-β）为模型,利用miRNAs sequencing方法对EMT相关的miRNAs的表达谱进行检测,构建miRNA-靶基因调控网络,并进行初步验证,以期探讨miRNA在NSCLC细胞EMT中的作用机制。方法:1.细胞培养及处理人非小细胞肺癌H358细胞株以及给予5ng/mL TGF-β1处理获得的H358EMT细胞模型（H358-TGF-β）,培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长,常规传代。2.细胞转染给予miRNA模拟物（mimics）以及阴性对照（NC miRNA）进行转染,将细胞分为阴性对照组（NC）和miRNA mimics转染组。3.Real-time PCR提取细胞总RNA,应用Real-time PCR方法,反转录合成cDNA,检测细胞中E-cadherin及GLI3在mRNA水平的表达;miRNA表达参照锐博公司RT-PCR说明进行检测。4.miRNAs sequencing检测由上海康城公司提供检测服务。送检细胞提取总RNA,采用NanoDrop ND-1000进行完整性与纯度鉴定,使用每个样品的总RNA制备miRNA测序文库,在Illumina NextSeq 500测序仪上进行50个cycle测序。测序完成后,使用Solexa CHASTITY质控筛选原始reads得到Clean Reads。利用miRNA靶基因预测软件预测top10差异miRNA的靶基因,并进行靶基因的GO和Pathway分析。5.GEO数据分析从GEO数据中筛选出两个TGF-β处理H358细胞EMT的表达谱芯片数据库—GSE49644和GSE79235,分析GLI3 mRNA在EMT过程中表达的变化。6.蛋白免疫印迹（Western blot）提取细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹方法检测细胞中E-cadherin或GLI3在蛋白水平的表达情况。7.统计方法应用SPSS Statistics17.0软件进行分析,数据分析采用两样本t检验、χ2检验,计量资料以均数±标准差（x±SD）表示。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1 miRNA sequencing方法筛选H358与H358-TGF-β细胞中差异表达的miRNAs1.1 miRNA sequencing检测结果H358-TGF-β细胞中共有88个miRNA表达上调,71个miRNA表达显著下调。其中,表达上调的前十位miRNAs上调的FC值在14.37237.51倍之间。表达下调的前十位miRNAs下调的比值在84%98%之间。1.2采用qPCR方法验证miRNA sequencing检测结果选择最显著变化的四个miRNAs进行PCR验证。与H358细胞相比,miR-381-3p、miR-146a-5p表达上调而miR-200c-3p、miR-203a-3p表达显著被抑制,与测序结果基本一致。2表达上调Top 10 miRNAs靶基因的预测及验证2.1表达上调Top 10 miRNA可能结合靶基因的预测每个miRNA可靶向几十上百个靶基因,但是上述miRNA间共同调控的靶基因较少。综合预测结果发现,miR-146a-5p、miR-411-5p、miR-495-3p以及miR-654-3p具有与CDH1的结合位点,其表达上调可能参与细胞EMT过程中上皮标记分子CDH1表达的调控。2.2过表达miRNAs对H358细胞中E-cadherin表达的影响将miR-146a-5p、miR-411-5p、miR-495-3p以及miR-654-3p模拟物瞬时转染H358细胞,PCR及Westernblot检测结果表明,miR-411-5p可抑制E-cadherin蛋白的表达。3表达下调Top 10 miRNAs靶基因的预测及验证3.1表达下调Top 10 miRNA靶基因的预测miR-203-3p、miR-200c-3p、miR-7-5p同时调控一个靶基因GLI3,并且在三种预测软件中均能预测到三者与GLI3的结合位点。提示H358-TGF-β细胞发生EMT后显著下调的三个miRNAs可能与GLI3基因3’-UTR区结合调控其表达。3.2验证miRNAs在EMT细胞中表达的变化与H358细胞相比较,miR-200家族三个miRNAs—miR-200c-3p/200b-3p/429的表达水平在H358-TGF-βEMT细胞中显著降低。此外,miR-203a-3p表达显著降低,与测序及前述结果基本一致。3.3检测GLI3在EMT细胞中表达的变化GLI3蛋白在H358TGF-β细胞的表达显著高于H358细胞,提示GLI3可能作为间叶性标记分子。3.4转染miRNA模拟物对H358-TGF-β细胞中GLI3表达的影响将miR-200c-3p/200b-3p/429、miR-203a-3p及miR-7-5p模拟物转染H358-TGF-β细胞观察对GLI3表达的影响。PCR结果表明,上述5个miRNAs均可显著抑制GLI3 mRNA的表达。Western blot结果进一步表明,过表达上述miRNAs可一定程度抑制GLI3蛋白表达,尤其以两个miRNAs联合转染为著。结论:1.给予H358细胞TGF-β1长期处理诱导细胞发生EMT后,miRNAs表达谱显著改变,88个miRNA表达上调,71个miRNA表达显著下调,表明miRNAs是参与EMT调控的重要生物分子。2.与H358-TGF-β细胞EMT相关且表达显著上调的top10 miRNAs分别为:miR-381-3p/146a-5p/379-5p/455-5p/409-3p/455-3/411-5p/654-3p/495-3p/323a-3p,其中miR-411-5p可抑制上皮标记分子E-cadherin蛋白表达。3.与H358-TGF-β细胞EMT相关且表达显著下调的top miRNAs分别为:miR-203-3p/205-5p/141-3p/200c-3p/34a-5p/141-5/95-3p/7-5p,其中miR-203-3p、200c-3p、miR-7-5p单独或联合过表达可显著抑制GLI3表达,提示miRNA—Hh/GLI3信号通路参与非小细胞肺癌EMT的调控过程。