乳腺癌是严重威胁妇女健康的一种恶性肿瘤。据统计,全球每年约有120万~140万妇女患乳腺癌,约有50万患者死于该病。近年来,我国妇女乳腺癌的发病率以年增长3%的速度逐年递增,有专家预计,20年后乳腺癌将是我国发病率最高的恶性肿瘤。统计还显示,我国妇女乳腺癌的发病年龄早于西方国家10年,发病高峰年龄为45~55岁,且年轻化趋势越来越明显,这就意味着乳腺癌每年将威胁着我国几十万妇女的生命、数十万家庭的完整和数百万劳动力的正常工作。因此,研究和了解与乳腺癌发生、发展的相关因素,对降低乳腺癌的发病率,提高患者生存率有重大意义。研究表明,乳腺癌的发生、发展是多步骤、多基因作用的结果。随着乳腺癌发病率的不断增加,对其易感基因、相关基因及其产物的研究已成为肿瘤学关注的热点问题。P73基因是Kaghad等在1997年偶然发现的一个新基因,其编码序列与p53基因具有相当的同源性,根据此基因编码的蛋白的分子量将其命名为p73基因。p73基因定位于人类1号染色体的短臂上的1p36.2-3区,而此区在神经母细胞瘤的细胞中为缺失的热点,在其它的肿瘤,比如乳腺癌,结肠癌,黑色素瘤中也经常发生缺失现象。和p53基因不同,p73基因转录后产生大量的剪切变异体。到目前为止,至少有6个p73的剪切变异体被发现,分别为p73α,p73β,p73γ,p73δ,p73ε和p73ζ。其中p73α是以全长形式表达的p73。14-3-3σ是14-3-3基因家族(包括β,ε,γ,η,τ,ζ和σ)中的一个成员,并且是14-3-3家族中唯一一个能够被DNA损伤所诱导的成员。14-3-3σ是一个细胞周期负调控因子,它的活化可以使细胞周期停滞于G2期,从而抑制细胞的生长。研究发现,14-3-3σ在人类乳腺肿瘤细胞中的表达呈下调趋势,可以作为人类乳腺上皮的一个特异性标记,14-3-3σ抑癌作用的消失可能是乳腺癌发生的一个重要原因。因此研究14-3-3σ在基因水平上的调节,对乳腺癌发生发展及预后的研究可能会有新的突破。研究已经证实,p53是14-3-3σ活化的主要调控因子, p63蛋白的一个异构体△Np63也可以调节14-3-3σ的活性,但是至今,关于p73基因与14-3-3σ活性之间的关系、以及在乳腺癌发生、发展中的表达还没有进行深入研究。本研究采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术和免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法(streptavidin peroxdase conjugated method,S-P)分别从转录水平和蛋白水平检测抑癌基因p73α和细胞周期负调节因子14-3-3σ在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织中的表达情况与相互作用;用RT-PCR、免疫沉淀、Western-blot和基因转染方法,探讨p53突变型人类乳腺癌细胞系MDA-MB-436中,p73α对14-3-3σ的调节作用;采用荧光素酶报告剂分析、RT-PCR、Western-blot和集落形成实验方法研究14-3-3σ对p73α基因转录活性的调节;应用基因转染、RT-PCR、Western blot和放线菌酮(cycloheximide,CHX)蛋白抑制分析的方法研究14-3-3σ对p73α基因稳定性的影响;应用细胞外源基因转染和免疫缺陷鼠乳腺癌移植模型方法,探讨在生物活体内,p73α和14-3-3σ抑制乳腺肿瘤生长的作用,进一步确认14-3-3σ的作用机制、以及p53和p73α基因对14-3-3σ的调节作用;结合回顾性分析乳腺癌组织p73α和14-3-3σ的表达与其临床生物学行为的关系,为乳腺癌的早期发现和靶向治疗提供新的分子生物学指标和靶点。同时,也在国内外首次阐明p73α对14-3-3σ的调节作用。主要研究内容和结果如下:第一部分乳腺良、恶性组织中p73α和14-3-3σ的表达及其与临床生物学行为关系的研究目的:通过检测p53家族中的新成员p73α和细胞周期负调控因子14-3-3σ在乳腺良、恶性组织中的表达,探讨上述两个基因在乳腺癌发生、发展中的相互作用,以及与乳腺癌临床生物学行为的关系。方法:采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术和免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法(streptavidin peroxdase conjugated method,S-P)分别从转录水平和蛋白水平检测抑癌基因p73α和细胞周期负调节因子14-3-3σ在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织中的表达情况与相互作用,并回顾性分析乳腺癌组织p73α和14-3-3σ的表达与其临床生物学行为(肿瘤大小、TNM分期、病理类型、组织学分级、腋淋巴结转移状况、有否脉管瘤栓、ER/PR、HER-2)的关系。结果:1 P73α基因在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织中的表达1.1 P73α基因的mRNA水平表达33例乳腺正常组织中,有25例p73α基因阳性表达,阳性率76%;33例癌旁组织中22例表达,阳性率67%;33例乳腺癌组织中20例表达,阳性率61%。乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织中p73α基因的矫正值(p73α/GAPDH)分别为0.8378±0.5921、0.9199±0.8441和0.6150±0.3756,经过统计学处理,三组之间无统计学差异(F=1.139,p=0.326)。1.2 P73α基因的蛋白表达33例乳腺正常组织中25例呈现p73α蛋白阳性表达,阳性率75.7%;33例癌旁组织中30例表达,阳性率90.9%;33例乳腺癌组织中10例表达,阳性率30.3%。经过统计学处理,三组中癌组织和癌旁组织、正常组织间蛋白表达有显著差异(χ2=17.860,p=0.000;χ2=8.726,p=0.003),而癌旁组织和正常组织间无统计学差异(χ2=3.385,p=0.066)。2 14-3-3σ在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织中的表达2.1 14-3-3σ的mRNA水平表达33例乳腺正常组织中14-3-3σ全部表达;33例癌旁组织中32例表达,阳性率97%;33例乳腺癌组织中,33例表达,阳性率100%。乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织中14-3-3σ矫正值( 14-3-3σ/GAPDH )分别为2.8231±1.9734、2.1950±1.8636和1.4680±0.8401。癌组织与癌旁组织、癌旁组织和正常组织之间14-3-3σ表达没有明显差异(p=0.075,p=0.123);但癌组织中14-3-3σ基因表达水平明显低于乳腺正常组织,其差异有统计学意义(F=5.640,p=0.005)。2.2 14-3-3σ的蛋白水平表达33例乳腺正常组织中18例强阳性表达,阳性率为54.5%;33例癌旁组织中11例强阳性表达,阳性率33.3%;33例乳腺癌组织中6例强阳性表达,阳性率18.2%。14-3-3σ的蛋白表达水平与细胞增殖呈负相关关系(r=-3.093, p=0.003);其中,正常组织和癌组织、癌旁和癌组织之间表达水平有明显差异(χ2=14.029,p=0.000;χ2=6.344,p=0.012),但正常和癌旁组织之间差异无统计学意义(χ2=2.752,p=0.097)。3 P73α蛋白表达与临床参数的关系76例入组患者中,病理有脉管瘤栓组p73α蛋白表达阳性率为16.7%(4/24),而无瘤栓组为40.4%(21/52),有统计学差异(χ2=4.185,p=0.034)。ER+PR+患者中,p73α蛋白表达阳性率72.7%(16/22),而ER-PR-组中,阳性表达率为33.3%(8/24),ER+PR-/ ER-PR+组中仅1例表达阳性,占3.3%(1/30),经过统计学分析,三组间两两比较均有显著差异(χ2=27.692,p=0.007)。p73α蛋白阳性表达与其他临床参数:临床分期(χ2=0.217,p=0.887)、有否腋淋巴结转移(χ2=0.007,p=0.564)、腋淋巴结转移数目(χ2=0.002,p=0.579)、肿瘤大小(χ2=0.953,p=0.329)、病理类型(χ2=1.907,p=0.167)、组织学分级(χ2=0.02,p=0.888)、HER-2过表达(χ2=1.931,p=0.126)无显著相关。4 14-3-3σ蛋白表达与临床参数的关系随着组织学分级的增高,14-3-3σ蛋白表达强阳性率降低,两者呈负相关关系(γ=-0.369,χ2=6.133,p=0.013);HER-2蛋白高表达(+++)者中,14-3-3σ蛋白表达强阳性率为16.8%(8/48),低表达组中,14-3-3σ蛋白表达强阳性者为44.4% (12/28),两组有统计学差异(χ2=6.173,p=0.014);14-3-3σ蛋白表达状况和病理组织学类型(χ2=1.462,p=0.227)、有否腋淋巴结转移(χ2=1.373,p=0.179)、腋淋巴结转移数目(χ2=0.468,p=0.349)、有否脉管瘤拴(χ2=1.684,p=0.154)、肿瘤大小(χ2=1.317,p=0.251)、临床分期(χ2=0.079,p=0.779)、雌孕激素受体状态(χ2=0.044,p=0.834)之间的关系无统计学差异。5 P53基因突变乳腺癌组织中14-3-3σ与p73α的相互关系76例乳腺癌患者中,p53蛋白表达阳性者45例,占59.2%。在45例p53基因突变乳腺癌中,p73α蛋白表达阳性且14-3-3σ表达阳性者占61.1%(11/18),p73α蛋白表达阴性且14-3-3σ表达阴性者占78.57%(22/28),两者呈正相关关系(r=0.384,χ2=6.490,p=0.013)。6乳腺癌组织中p53与p73α蛋白表达的相互关系p53蛋白表达阳性组中,p73α蛋白阳性表达率为42.2%(19/45),而p53蛋白表达阴性组中,p73α蛋白阳性表达率仅为19.35%(6/31),两者呈正相关(r=0.239,χ2=4.919,p=0.027)。结论:1 P73α基因在乳腺正常组织和良性组织中表达明显高于癌组织,p73α蛋白高表达与乳腺肿瘤组织脉管瘤栓呈负相关,且多见于ER+PR+患者。提示作为抑癌基因,p2 73α基因表达的衰减与乳腺肿瘤的形成和发展相关。3乳腺组织由正常→增生→癌变过程中,细胞周期负调控因子14-3-3σ强阳性表达呈衰减趋势,且与组织学分级、HER-2强阳性表达呈负相关,提示其可能为乳腺癌发生、发展中的重要抑制因子。4 P53蛋白高表达和p73α基因阳性表达正相关,并且在p53基因突变乳腺癌组织中,p73α基因与14-3-3σ表达呈正相关关系,提示:当p53基因发生突变时,p73α基因表达增高,以替代p53上调下游因子14-3-3σ发挥抑制细胞增殖的作用。第二部分P53突变型乳腺癌细胞系中p73α对细胞周期负调控因子14-3-3σ的调节作用目的:探讨p53突变型人类乳腺癌细胞系MDA-MB-436中,阿霉素诱导DNA损伤后,p73α对细胞周期负调控因子14-3-3σ的调节作用,确认p73α和14-3-3σ的相互关系。方法:采用噻唑蓝(MTT)分析方法测定阿霉素处理后的p53突变型人类乳腺癌细胞系MDA-MB-436和p53野生型乳腺癌细胞系MCF-7的细胞生存率;用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫沉淀、Western blot和基因转染方法,测定基因转染前后两种细胞系中p53、p73α基因以及14-3-3σ的基因表达状况。结果:经阿霉素处理24h和48h后,MCF-7的细胞生存率分别是50.20%和16.58%,MDA-MB-436为99.20%和98.62%(p<0.01),即p53突变型细胞系对阿霉素耐药;在p53突变型细胞系MDA-MB-436中,阿霉素诱导DNA损伤后,p73α基因表达水平轻微上调,14-3-3σ表达水平明显下调;转染外源性p73α于MDA-MB-436细胞系后,14-3-3σ的表达水平明显上调,经阿霉素处理24h和48h后的MDA-MB-436的细胞生长率分别为58.20%和24.66%(p<0.01)。结论:在p53突变型人类乳腺癌细胞系中,p73α可以代替p53诱导其下游基因14-3-3σ的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增长,为非p53依赖型乳腺癌的治疗提供新途径。第三部分14-3-3σ对p73α基因转录活性的影响目的:p53是14-3-3σ的主要调节基因,活化p53可以诱导14-3-3σ的表达,反过来14-3-3σ又可以稳定p53的表达并且增加其转录活性。p53基因家族中的其它成员p63和p73也存在着一些与p53基因相似的功能。本研究目的在于探讨14-3-3σ对p73α基因转录活性的影响。方法:选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299和p53突变型人类乳腺癌细胞系MDA-MB-436,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western-blot和集落形成实验的方法研究14-3-3σ对p73α基因转录活性的调节。结果:荧光素酶报告剂分析结果显示,在H1299细胞系中,对照组、单独转染p73α组以及p73α和14-3-3σ共转染组之间,bax和p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达均存在显著差异(p<0.01),且荧光素酶表达和14-3-3σ转染剂量之间存在浓度依赖性(p<0.01)。RT-PCR和Western-blot也显示,对照组、单独转染p73α组以及p73α和14-3-3σ共转染组之间,bax和p21WAF1的表达也存在显著差异(p<0.01)。集落形成实验结果显示,在MDA-MB-436细胞系中,对照组、单独转染p73α组以及p73α和14-3-3σ共转染组之间,G418筛选后,细胞的死亡程度存在显著差异(p<0.01)。结论: 14-3-3σ可以增加p73α基因的转录活性,并且14-3-3σ对p73α基因转录活性的调节存在剂量依赖性关系。第四部分P53突变型乳腺癌细胞系中14-3-3σ对p73α稳定性的影响目的:探讨在p53突变乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,14-3-3σ对p73α基因稳定性的影响。方法:采用基因转染、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和放线菌酮(cycloheximide,CHX)蛋白抑制分析的方法研究14-3-3σ对p73α基因稳定性的影响。结果:RT-PCR显示,单独转染1μg的p73α后,p73α与actin的灰度值比为0.635;转染1μg p73α+1μg 14-3-3σ和1μg p73α+2μg14-3-3σ后,p73α与GAPDH的灰度值比分别为0.643和0.631,各组比值之间均无显著性差异(p>0.05)。Western-blot显示,单独转染1μgp73α后,p73α与GAPDH的灰度值比为0.333;转染1μgp73α+1μg14-3-3σ和1μgp73α+2μg14-3-3σ后,p73α与GAPDH的灰度值比分别为0.797和0.826,各组比值之间有显著性差异(p<0.01)。放线菌酮蛋白抑制分析显示,单独转染p73α的对照组,放线菌酮处理0h,1h,2h,4h,6h后,p73α与GAPDH灰度比值分别为0.075,0.166,0.124,0.100,0.092;而共转染p73α和14-3-3σ的实验组结果分别为0.963,0.244,0.244,0.234,0.185,两组间有显著性差异(p<0.01)。结论:在转录水平上,14-3-3σ不影响p73α基因的稳定性;而且在蛋白表达水平上,14-3-3σ可以增加p73α基因的稳定性。第五部分P73α和14-3-3σ抑制乳腺肿瘤生长的体内实验研究目的:探讨在生物活体内,p73α和14-3-3σ抑制乳腺肿瘤生长的作用,进一步确认14-3-3σ的作用机制、以及p53和p73α基因对14-3-3σ的调节作用。方法:应用细胞外源基因转染和免疫缺陷鼠乳腺癌移植模型方法、将p53、p73α基因和14-3-3σ按不同的实验分组导入p53突变型人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,经过细胞培养,接种于雌性裸鼠皮下,并静脉注射治疗量的阿霉素进行干预,观察肿瘤的生长情况。结果:接种后第4周和第6周,分别发现对照组和单独转染14-3-3σ组裸鼠皮下有肿瘤生长,经过病理学证实为乳腺癌。单独转染p53基因和p73α基因组、共转染p53基因/14-3-3σ和p73α基因/14-3-3σ组均无肿瘤生长。裸鼠尾静脉注射阿霉素(adriamycin,ADR)组无乳腺肿瘤生长。结论:1在活体内,细胞周期负调控因子14-3-3σ存在活化和非活化两种状态,活化状态下的14-3-3σ可以发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用,而稳定状态的14-3-3σ无抑制肿瘤生长的作用。2 P53基因和p73α基因都是14-3-3σ主要的上游调控基因,当细胞DNA受到损伤时,他们不但上调14-3-3σ表达、并且使其由稳定状态转向活化,发挥细胞周期负调控因子作用,从而抑制肿瘤生长。3作为抑癌基因,p53基因和p73α基因可以多途径抑制裸鼠乳腺肿瘤细胞的生长,具体机制有待于进一步研究。