五味清浊散,别名“通拉嘎-5”,始载于《后序医典》。作为一个体现蒙医治病特色的代表方剂,具有清浊生华的作用以及复原精微的功效,1985版《中华人民共和国药典》首次将其载入,其药物组成为石榴,肉桂、豆蔻、荜茇、红花。具有开郁消食,暖胃的功效。《药典》记载其主要用于食欲不振,消化不良,胃脘冷痛,满闷嗳气,腹胀泄泻等病症。传统蒙医理论认为“清浊生华”既是人体内不断进行的新陈代谢,也是人体基本物质基础——“七素三根”分解的基础,而人体的新陈代谢大体可以通过消化系统和“清浊生华”系统进行。食物营养物质自从胃内吸收消化开始到形成代谢终产物的功能过程称之为“清糟归精、分别清浊”,是“精华”(营养精微)和“浊物”(糟粕)之间不断相互转化和分化的过程,五味清浊散能够祛“巴达干”而不生热,调节寒热,改善精微代谢之效。根据蒙医“清浊生华”理论,蒙医临床上,五味清浊散已经广泛被用于治疗高脂血症,但是对其治疗高脂血症的作用机制研究甚少。目的:从蒙医“清浊生华”理论出发,基于网络药理学的方法预测五味清浊散降脂的分子机制,采用高脂饲料喂养诱导的金黄地鼠高脂血症模型评价五味清浊散降脂作用,并对其抗高脂血症的分子机制进行探索,从整体上评价五味清浊散降脂作用时,也其适应症的扩展提供实验数据支撑。方法:(一)基于公共数据库的五味清浊散抗高脂血症作用的网络药理学研究1.五味清浊散化合物的收集及活性化合物的筛选。通过中药系统生物学数据库和分析平台数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、化学专业数据库化学成分进行搜集,并且通过TCMSP 数据库吸收、分布、代谢、排泄参数(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME)进行活性化学物筛选。2.五味清浊散活性化合物候选靶点的收集。通过TCMSP数据库获得活性化合物对应靶点,并通过Uniprot数据库获得靶点的基因名,并利用TBtools工具绘制文恩图初步分析活性成分候选靶点的相互关系。3.高脂血症疾病靶点的收集。通过TTD、OMIM、Drugbank和Genecards四个数据库收集全面高脂血症已知靶点。4.蛋白质相互作用网络的构建。利用STRING数据库,进一步获得候选靶点蛋白质相互作用数据,并采利用相同方法获得高脂血症疾病靶点的蛋白质相互作用数据。5.网络的构建和分析。利用Cytoscape软件,构建出“五味清浊散活性成分-活性靶点”、候选靶点PPI以及高脂血症疾病靶点PPI网络。利用Cytoscape中的Merge工具,分别构建五味清浊散候选靶点和高脂血症疾病靶点的交集网络以及五味清浊散候选靶点PPI数据和高脂血症疾病靶点PPI数据的交集网络。6.利用Metascape数据库,提交两个交集网络靶点集,进行GO注释和KEGG通路的富集分析。(二)五味清浊散抗高脂血症的药效研究1.高脂血症动物模型的建立及给药分组。确认造模成功后,根据血脂四项的数据,随机将高脂饲料饲养金黄地鼠组分为模型组,五味清浊散低剂量组(0.78g/kg五味清浊散),五味清浊散高剂量组(3.12g/kg五味清浊散)。2.血清当中总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、总甘油三酯(Total Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low Density Lipoproteins,LDL-C)、高密度脂蛋白(High Density Lipoproteins,HDL-C)以及谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)的检测。造模5周和给药8周之后,前12 h禁食不禁水。麻醉后,毛细血管眼眶取血,静置30min,以3000 rpm离心20min,取上清液,于-20℃保存备用。利用AU480日本奥林巴斯株式会社全自动生化仪检测血脂四项及ALT、AST。3.肝组织的病理变化。给药8周后,麻醉处死金黄地鼠后,取肝脏组织,选择其最大叶置于4%多聚甲醛当中,其余肝组织于-80℃冻存备用,利用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,H&E Staining)和油红O染色分别评价肝组织的病理变化和脂肪积累4.体重和肝脏指数的检测。每周称取各只金黄地鼠体重,给药八周实验结束后,取地鼠完整肝组织,称金黄地鼠肝脏质量(mg),计算金黄地鼠肝脏指数(肝脏指数=金黄地鼠肝脏质量(mg)/金黄地鼠体重(g))(三)五味清浊散抗高脂血症机制的初步研究1.采用蛋白印迹(Western blot,WB)的方法,检测高脂血症金黄地鼠肝脏组织的胆固醇排泄效应蛋白胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoAReductase,HMGCR)蛋白表达量;腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)和乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase,ACC)的激活和固醇调节元件结合蛋白-2(Sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)的蛋白表达量;凋亡相关基因蛋白人体抑癌基因编码蛋白p53和B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)的表达。2.采用UHPLC-ESI-Q-Orbitrap Plus MS对五味清浊散成分和入血成分进行指认,并利用分子对接软件Autodock vina将指认获得的化合物与降脂相关蛋白进行分子对接。结果:1.五味清浊散活性化合物的筛选。通过TCMSP和化学专业库两个化学成分数据库总共收集到540个化合物,通过OB≥30%和DL≥0.1两个ADME参数筛选,并增加了一些低OB值和低DL值但是文献记载具有高活性的化合物,共收集到212个化合物,石榴、红花、荜茇、豆蔻、肉桂分别收集到34,68,51,52,55个活性化合物。2.五味清浊散活性化合物-候选靶点网络的建立和分析。基于TCMSP数据库,五味清浊散212个活性化合物共收集到219个候选靶点,161个来自于石榴,176个来自红花,94个来自荜茇,136个来自豆蔻和103个来自肉桂,5个单味药具有各自特有靶点,同时也具有64个共同靶点,将活性化合物和候选靶点构建出一个由429个节点和4213条边组成的“五味清浊散活性化合物-候选靶点”的网络。3.五味清浊散抗高脂血症的潜在靶点的确认。从TTD,OMIM,DrugBank,GeneCards 4个疾病相关数据库一共获得349个高脂血症的疾病靶点,每个数据库分别贡献了各自特有的靶点,TTD(8个),OMIM(19 个),DrugBank(11 个),GeneCards(269 个)。再利用 TBtools 软件获得了一个有43个靶点的五味清浊散候选靶点和高脂血症疾病靶点的交集网络(43个节点,289条边),最终获得了一个111的节点和1847条边的PPI交集网络。对degree值和betweenness值的中位数分别为31和0.0034,获得一个45个靶点的交集网络重要靶点(45个节点和792条边)。4.五味清浊散抗高脂血症潜在靶点的富集分析Metascape 在生物过程(biological process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)、细胞组分(cellular components,CC)三个方面富集结果的内容涉及较广,同时分析了出了两个靶点集的共有和特有通路。BP富集分析结果提示两个靶点集存在较多共同生物过程。其中大量的生物过程与脂质代谢相关:脂质生物合成调节(regulation of lipid biosynthetic process),脂质分解代谢进程调节(regulation of lipid catabolic process),脂代谢负调节(negative regulation of lipid metabolic process)与脂代谢正调节(positive regulation of lipid metabolic process),脂质分解代谢调节(regulation of lipid catabolic process),脂质分解代谢负调节(negative regulation of lipid catabolic process),脂质代谢进程调节(regulation of lipid metabolic process),脂质定位相关(lipid localization),与脂代谢相关的脂质细胞反应(cellular response to lipid concerned with metabolism of lipid);同时,还有大量生物过程与激酶调节相关,调节MAP激酶活性(regulation of MAP kinase activity),蛋白激酶活性(protein kinase activity);此外,在先PPI后再交集的潜在靶点集当中出现了较多与细胞增殖凋亡相关的特有生物进程:细胞增值负调节(negative regulation of cell proliferation),细胞增值负调节(negative regulation of cell proliferation)和细胞凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)等,众多的生物进程结果提示五味清浊散靶点具有脂质代谢、激酶代谢在内的多种生物进程,展现出良好的与高脂血症相关脂代谢的生物进程。而MF和CC富集分析提示两个靶点集存在着共同的通路但是数量少于BP。MF提示五味清浊散的靶点主要行使结合活性相关分子功能,例如,脂质和磷酸酶结合(lipid and phosphatase binding),受体配基(receptor ligand),生长因子(growth factor)以及生长因子活性(growth factor activities)等。最后,CC 富集分析提示五味清浊散的靶点主要细胞组分为膜筏(membrane raft),受体复合型(receptor complex),膜位(membrane region)等。五味清浊散的降脂效应的KEGG信号通路富集共获得145条通路p<0.01,其中两个靶点集共同通路54条,交集网络富集通路6条,PPI交集网络富集通路85条。揭示其涉及多种通路发挥效应。两个靶点集合共有的主要是糖尿病综合征 AGE-RAGE 的信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications),脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine signaling pathway),胰岛素信号通路(insulin signaling pathway),与 ErbB 相关的激酶功能(kinase function according to ErbB),MAPK 信号通路(MAPK signaling pathways),AMPK 信号通路(AMPK signaling pathways),PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathways);而其中凋亡(apoptosis)为PPI交集网络靶点集特有信号通路。多途径的信号通路五味清浊散抗高脂血症的机制存在着相互交互多途径的可能性。5.五味清浊散抗高脂血症的药效学实验验证在高脂饲料饲喂5周之后,血脂四项(TC,TG,LDL-C,HDL-C)与空白对照组相比,高脂饲料喂养组均升高(P<0.05);采用五味清浊散干预8周,五味清浊散能够剂量依赖性地降低TC(P<0.05),TG,LDL-C进一步降低血脂缓解高脂血症。血清中ALT结果也提示五味清浊散能够显著降低血清当中的ALT(P<0.05)进一步改善肝功能,但是五味清浊散不能改善体重和肝脏体重比。肝脏病理H&E染色发现五味清浊能够改善脂质积累导致的肝细胞水肿,局灶性变性和坏死;油红O染色发现五味清浊散能够缓解肝组织当中的脂肪积累。6.五味清浊散抗高脂血症作用机制的初步研究通过WB检测肝脏组织中的HMGCR,CYP7A1,p-AMPKα,p-ACC,SREBP-2,p53,Bcl-2的蛋白表达量。与空白对照组相比,高脂饲料饲养组的HMGCR的表达显著升高,而CYP7A1的显著降低,与高脂饲料饲养组相比,发现不同剂量的五味清浊散组的HMGCR的表达显著降低(P<0.05),而CYP7A1的表达增高;与空白对照组相比,高脂饲料饲养组的p-AMPKα的表达显著降低(P<0.05),而与高脂饲料饲养组相比,五味清浊散高剂量组p-AMPKα,p-ACC的显著升高(P<0.05)。而SREBP-2的表达上,与空白对照组相比,SREBP-2有升高趋势,但是五味清浊散对于SREBP-2的表达没有影响;与高脂饲料饲养组相比,发现五味清浊散干预组有降低p53的表达,增高Bcl-2的表达的趋势,但是均没有显著性。通过高分辨质谱结合文献多级碎片离子解析,在正负离子下最终指认了 13个化合物,比对血浆样品,在血浆9个时间点当中均出现了胡椒碱,以胡椒碱为例,采用分子对接结果显示胡椒碱与HMGCR蛋白之间自由能为-8.0(kcal/mol),HMGCR蛋白与胡椒碱通过2个氢键发挥作用,HMGCR蛋白上的792位的甲硫氨酸(MET)残基与胡椒碱的羰基结合,蛋白696位上的异亮氨酸(ILE)与胡椒碱上五元环上的氧键结合。CYP7A1蛋白与胡椒碱之间自由能为-8.1(kcal/mol),HMGCR蛋白与胡椒碱通过1个氢键发挥作用,CYP7A1蛋白上的48位的苯丙氨酸(PHE)残基与胡椒碱的羰基结合。结论:本研究采用网络药理的方法,发现五味清浊散抗高脂血症呈现出多靶点、多途径的特点,全面提示五味清浊散在传统理论指导下抗高脂血症作用的可能性;药效实验结果表明五味清浊散能够降低血脂,改善肝脏功能,减轻高脂导致的肝组织病变和脂质积累症状;基于“清浊生华”理论,五味清浊散抗高脂血症的作用机制可能与五味清浊散激活AMPKα磷酸化抑制HMGCR表达抑制肝组织胆固醇合成,增加CYP7A1表达增强胆固醇的的排泄相关,发挥降脂作用的主要物质基础之一可能是胡椒碱,此外,五味清浊散抑制肝细胞凋亡可能与其保护肝脏组织功能相关;基于网络药理学的方法也为现代民族药及其复方的研究提供了新的思路,相关研究发现也为阐述五味清浊散通过蒙医药传统“清浊生华”的理论从肝出发治疗高脂血症提供了科学依据。