第一部分BRSK2调控胰岛β细胞胰岛素分泌的功能发现以及相关调控机制的研究　　BRSK2是AMPK家族中的一个重要成员。早先的研究认为，BRSK2的主要作用是在脑中参与了神经系统的极化和神经递质释放的突触前调节。我们在研究中发现，BRSK2在人胰腺的胰岛组织中高丰度表达，并且这种表达也存在于小鼠胰岛瘤β细胞MIN6中。这提示BRSK2在胰岛β细胞中的生物学功能可能与胰岛素分泌的调节相关联。　　我们以小鼠胰岛瘤细胞株MIN6作为胰岛素分泌研究的实验材料，该细胞株属于胰岛β细胞系列，能够正确的反应胰岛素分泌状况。我们发现MIN6细胞过量表达BRSK2时在高糖刺激下的胰岛素分泌量受到明显的抑制，并且这种抑制效应是激酶活性依赖性的;而内源BRSK2被干扰后的MIN6细胞受高糖刺激后胰岛素分泌没有任何变化，但低糖刺激下胰岛素分泌量出现非正常的增加。此外，还发现BRSK2的蛋白表达量和激酶活性均受到葡萄糖浓度的调节，激酶只在低糖条件下被激活，在高糖情况下几乎没有活性。　　既然BRSK2能够抑制高糖刺激下的胰岛素分泌量，那么探索这种负调控行为的分子机制无疑是一项十分有意义的研究。我们应用Clonetech酵母双杂交系统，以BRSK2作为诱饵筛选到了BRSK2的互作蛋白PCTK1。研究发现，过量表达的BRSK2和PCTK1能够在细胞的胞质中共定位，体内和体外的互作实验均显示两者之间互作关系。体外磷酸化实验还证明PCTK1是BRSK2的下游激酶，BRSK2能够磷酸化PCTK1的片段Fa(PCTK1-Fa，aa1-128)的第12位丝氨酸。　　我们将PCTK1的第12位丝氨酸分别突变成不能被BRSK2磷酸化的丙氨酸(S12A)和能够持续磷酸化的谷氨酸(S12E)，另外也构建了PCTK1的另外两个已知突变体——激活型突变体S153A和失活型突变体K194M。将构建好的质粒转染入MIN6细胞中。实验结果证实，PCTK1能够抑制高糖刺激下的胰岛β细胞的胰岛素释放量，并且这种抑制作用是激酶活性依赖性的，即PCTK1-S12E和PCTK1-S153A的转入同样能够起到显著的抑制作用。此外，我们用RNAi消减MIN6细胞中的内源PCTK1蛋白，检测胰岛素分泌，结果与消减内源BRSK2的效应一致。而在消减了BRSK2的MIN6细胞中同时转染外源PCTK1后，这种消减产生的效应得到了补偿修复。综合以上，我们可以看出BRSK2能够通过对PCTK1第12位丝氨酸的磷酸化作用，增强PCTK1的激酶活性，从而抑制胰岛β细胞在高糖刺激下的胰岛素分泌量。　　综上所述，本文研究首次揭示了BRSK2和PCTK1在胰岛β细胞中调控胰岛素分泌的关键性作用，并且首次证实BRSK2和PCTK1之间的相互作用以及这种相互作用所引起的胰岛素分泌抑制效应。我们研究证实BRSK2只有在低糖条件下才会被激活，而在高糖情况下几乎没有活性。因此，我们通过本文研究认为，在胰岛β细胞MIN6中，BRSK2是该细胞在低糖环境下胰岛素释放的一个重要负调节因子，它的这种抑制效应是通过对PCTK1的磷酸化作用来实现的。　　第二部分人类新基因LDHAL6A的克隆和功能初步研究　　乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，EC1.1.1.27，LDH)是糖酵解过程中的一个关键酶。在本研究中，我们克隆到了一个新的人类乳酸脱氢酶基因LDHAL6A(Lactate dehydrogenase A-like6A)，并且对该基因的一些基本特征进行了初步探讨。LDHAL6A全长ORF为999bp，编码332个氨基酸残基。UCSC基因组数据库显示，该基因有7个外显子，6个内含子，定位于人类染色体11p15.1。通过RT-PCR实验方法分析，LDHAL6A在人类睾丸组织中呈现特异性表达。亚细胞定位的结果显示，过量表达的LDHAL6A蛋白主要定位于COS7细胞的细胞质中。此外，我们还利用原核表达系统外源表达得到带有GST-tag的LDHAL6A融合蛋白，发现该蛋白在体外具有乳酸脱氢酶的活性，能够以NADH为辅酶，将丙酮酸还原成乳酸。并且在真核系统中，用双荧光素酶报告系统检测，发现在HEK-293T细胞内过量表达LDHAL6A，能够提高AP1(PMA)信号通路的转录活性。