实验目的:　　 通过蛋氨酸脑啡肽(MENK)在体内外对小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)亚群分化的诱导,树突状细胞免疫表型、生物学活性、抗原提呈功能的调控,从而探讨MENK调控鼠骨髓来源树突状细胞分化、诱导Th1型免疫应答及抗肿瘤的作用的机制。为进一步发掘DCs的免疫潜能,使其在抗肿瘤反应中发挥最大作用奠定基础,继而为肿瘤的治疗提供广阔的前景。　　 实验方法:　　 首先,研究蛋氨酸脑啡肽对小鼠树突状细胞亚型分化的诱导及调控。从7-8周龄的C57BL/6小鼠骨髓提取骨髓细胞诱导培养,经CD11c免疫磁珠分选,获得纯化的树突状细胞。流式细胞仪分析表明,CD11c(树突状细胞的特异性标记)阳性细胞纯度达85%以上。采用倒置荧光显微镜观察不同浓度的(10-8-10-14mol/L)MENK体外诱导的树突状细胞的形态变化,采用流式细胞仪分析梯度浓度的MENK体外诱导骨髓树突状细胞前体后其CD11c+CD11b+DC和CD11c+CD11bCD45R/B220+DC亚群的变化规律和固定量的MENK(20mg/kg注射量)体内诱导DC亚群分化的特点,以及体内外共刺激分子CD80,CD40和MHC-Ⅱ分子的表达进而确定MENK体外最佳诱导浓度。其次,研究蛋氨酸脑啡肽对树突状状细胞免疫学功能的调控。用酶联免疫吸附(ELISA)法,检测了不同体外诱导条件下,各组骨髓树突状细胞前体来源的树突状细胞上清中的IL-12p70和IL-10含量,进而从诱导的树突状细胞分泌细胞因子的特点判断MENK对Th1/Th2型反应的定向调控;同时用RT-PCR的方法检测了各组诱导的树突状细胞其κ,δ,μ阿片受体及细胞内TNF-α和TLR-4的mRNA水平;在诱导的树突状细胞和T淋巴细胞共培养的条件下,用MTr法测定了T淋巴细胞的增殖能力;采用MTT法配合倒置荧光显微镜和流式细胞术测定了10-12mol/LMENK(MENK-12),LPS,IL-3,G+I诱导剂诱导的树突状细胞的对MCF-7肿瘤细胞的抑制率及体外凋亡的情况;同时采用Twestern-Blot检测了体外诱导的树突状细胞凋亡蛋白TRAIL蛋白的分泌情况。在体内试验中,制备了荷瘤鼠模型,在MENK(20mg/kg注射量)的作用下,采用流式细胞仪检测了体内树突状细胞诱导肿瘤凋亡的能力并比较了小鼠的生存率、抑瘤率;同时将用MENK-12体外诱导的树突状细胞进行了体内回输检测其生存率、抑瘤率。最后,在MENK对树突状细胞亚群分化诱导及免疫学功能调控的的基础上,进一步探讨了MENK对树突状细信号转导通路TLR-4-NF-κb信号活化的意义。用Westen-Blot的方法,定量检测了MENK对树突状细胞信号转导通路相关蛋白NF-κb和TLR-4的表达。　　 实验结果:　　 1、在树突状细胞亚群分化方面,无论是在体内还是在体外,MENK均定向的诱导树突状细胞像髓系发展,在体外诱导中,在MENK浓度为10-12mol/L的时,共刺激分子CD80,CD40,MHCⅡ达到最高值,表明MENK是最佳诱导浓度是10-12mol/L。　　 2、ELISA结果表明MENK-12(10-12mol/LMENK)诱导树突状细胞分泌的IL-12p70的含量高于IL-10,表明MENK-12能够定向诱导TH1型反应,RT-PCR的结果表明,经MENK-12诱导的的树突状细胞能够上调阿片受体及细胞内TNF-α和TLR-4的mRNA水平。Western-Blot检测结果证实了MENK-12增加了树突状细胞分泌TRAIL蛋白的的能力。MTT结果表明MENK-12能够刺激树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞的增殖能力,流式结果表明MENK在体内外均能诱导肿瘤细胞的凋亡坏死并可以显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间,其生存率明显高于模型对照组。　　 3、Western-Blot结果表明MENK-12能够上调骨髓树突状细胞前体来源的树突状细胞TLR-4的表达,从而活化TNF-κb信号通路。　　 结论:　　 1、MENK能够在体内外诱导树突状细胞向髓系分化,并且上调共刺激分子的表达。　　 2、MENK能够上调树突状细胞的免疫学功能,增强其抗肿瘤活性。　　 3、MENK可以活化TLR-4-NF-κb信号通路增强树突状细胞的功能,调节免疫反应。