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目的探讨同型半胱氨酸在血管平滑肌细胞凋亡中的作用和机制。方法组织贴块法培养人脐动脉平滑肌细胞;不同浓度的同型半胱氨酸培养液(0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L)分组培养血管平滑肌细胞24h,终浓度的同型半胱氨酸培养液(1000μmol/L)分组培养血管平滑肌0h、6h、12h、24h、48h;流式细胞仪术和细胞基因组DNA Ladder检测同型半胱氨酸诱导的人血管平滑肌细胞凋亡;免疫细胞化学技术对平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1,胞浆caspase-8及核蛋白NF-κB的表达进行定位观察和定量检测;western blot技术进一步定量分析上述四种蛋白的表达强度;分光光度法检测caspase-8的活性和电泳迁移率改变分析法检测NF-κB的活性;最后应用RT-PCR技术对死亡受体Fas、TNFR1 mRNA的表达进行观察。实验数据以均数±标准差表示,计量资料采用方差分析,计数资料采用卡方检验,SPSS16.0软件进行统计学分析,P<0.05差异有统计学意义。结果(1)流式细胞术和细胞基因组DNA Ladder检测均表明同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞凋亡呈浓度和时间依赖性。(2)免疫细胞化学定位观察见Fas和TNFR1蛋白着色定位主要在胞浆,少数见胞膜着色,casepase-8蛋白着色定位在胞浆,NF-κB蛋白着色定位在胞浆和胞核,四种蛋白的阳性表达产物均为均匀分布的棕黄色颗粒状物。专业图像分析系统对四种蛋白表达的光密度进行统计分析,发现四种蛋白的表达强度与同型半胱氨酸的干预存在浓度和时间依赖性趋势(P<0.05),western blot技术证实了上述检测结果。(3)分光光度法检测caspase-8的活性变化与同型半胱氨酸干预呈浓度和时间依赖性;电泳迁移率改变分析法检测NF-κB的活性变化与同型半胱氨酸的干预亦存在浓度和时间依赖性;RT-PCR技术检测发现随同型半胱氨酸作用时间和浓度的增加,死亡受体Fas、TNFR1 mRNA的表达随之增加。结论1、同型半胱氨酸呈浓度和时间依赖性诱导人血管平滑肌细胞凋亡。2、同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的途径可能是通过上调死亡受体(Fas和TNFR1)的表达,激活胞浆casepase-8的活性,增加NF-κB核转录来实现的。目的从分子生物学水平探讨叶酸拮抗同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用及机制。方法组织贴块法培养人脐动脉平滑肌细胞,500μmol/L的Hcy培养液培养VSMCs 24h,500μmol/L的Hcy培养液和750ng/L的叶酸共同培养VSMCs 24h,流式细胞术和细胞基因组DNA Ladder检测叶酸干预前后同型半胱氨酸诱导人VSMCs的凋亡率;免疫细胞化学技术观察两组VSMCs死亡受体蛋白Fas、TNFR1,胞浆蛋白caspase-8及核蛋白NF-κB表达强度的变化;分光光度法检测两组VSMCs caspase-8的活性变化,电泳迁移率改变分析法检测NF-κB的活性变化,RT-PCR检测两组细胞死亡受体Fas和TNFR1 mRNA的变化。实验数据以均数±标准差表示,计量资料采用方差分析,计数资料采用卡方检验,SPSS16.0软件进行统计学分析,P<0.05差异有统计学意义。结果(1)流式细胞术和细胞基因组DNA Ladder检测均显示叶酸降低Hcy诱导的人VSMCs凋亡率(P<0.05)。(2)免疫细胞化学技术可见叶酸干预后四种蛋白的阳性表达产物较前减少(P<0.05)。(3)分光光度法显示叶酸干预后caspase-8的表达较前减少(P<0.05)。(4)电泳迁移率改变分析法检测示叶酸干预后NF-κB核转录蛋白较前减少(P<0.01)。(5)RT-PCR技术检测示叶酸可明显降低死亡受体Fas和TNFR1 mRNA的表达(P<0.01)。结论1、叶酸可降低Hcy诱导的人VSMCs凋亡率。2、叶酸可减少Hcy诱导的人VSMCs死亡受体(Fas和TNFR1)表达,降低caspase-8的活性及NF-κB的核转录过程。