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赤羽病(Akabane disease,AKA)又称阿卡班病,是由阿卡班病毒(Akabane virus,AKAV)引起牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿畸形、以及先天性关节弯曲-积水性无脑综合征(简称AH综合征)的一种动物虫媒传染病,传播媒介主要是蚊和库蠓等吸血昆虫。1990年,首次证实该病在我国存在,随后调查发现我国大部分省区存在该病。AKA的暴发给畜牧业造成了严重的经济损失,是我国动物疾病防制和国际动物贸易中的重点检疫对象。
本研究以AKAV YN株的核蛋白基因为研究对象,成功构建核蛋白基因pBAD-AKAV-N表达载体,将表达载体转入大肠杆菌,用阿拉伯糖诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,表达产物分子量与预期的大小42.5 kDa相符,表明成功表达了重组核蛋白。
用纯化的赤羽病病毒作为抗原,包被ELISA板,用抗AKAV特异性单克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测AKAV抗体的竞争ELISA(c-ELISA)检测方法。用c-ELISA方法检测AKAV阳性血清及其它病毒阳性血清,结果表明该方法具有良好的特异性,并且与其它病毒血清无交叉反应。用该c-ELISA方法检测参考样品223份,结果表明该c-ELISA的特异性和敏感性分别是96.1％和94.3%。
根据GenBank登录的赤羽病核蛋白基因S RNA核苷酸序列设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测赤羽病病毒的实时荧光定量PCR方法,所制作的标准曲线表明,在5.8×107～5.8拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.998),最少可检测到5.8拷贝/μL的阳性质粒。
设计针对AKAV、BTV、VSV、EHDV四种虫媒病的引物,初步建立了赤羽病病毒、蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)和水泡性口炎病毒(VSV)的多重RT-PCR鉴别检测方法。
本研究成功建立了3种快速检测赤羽病的方法,不仅为我国赤羽病的流行病学调查及诊断提供了方法,也为动物赤羽病的进出境检疫提供了手段。