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大量棉纤维相关基因在棉纤维不同发育时期特异表达,控制着纤维的伸长和发育。单细胞结构的棉纤维为研究纤维相关基因在纤维发育中的功能提供了一个良好的实验系统。棉花纤维发育相关基因的克隆和遗传转化体系的建立为棉花目标性状的遗传改良和重要基因的功能验证奠定了基础。本实验利用反向遗传学技术,研究棉花果胶盐裂解酶(Pectate lyase,PEL)基因GhPEL在棉纤维发育中的功能。GhPEL是棉纤维特异表达的基因,在根、茎、叶、胚珠中都微弱表达,主要在开花后5-15天(DPA)的纤维中表达,在10 DPA的纤维中表达量最高。通过原核表达技术,从大肠杆菌中纯化到预期大小的棉花果胶裂解酶蛋白,酶活性测定发现其具有典型的果胶裂解酶活性。为进一步研究该基因的功能,用pBI121质粒载体构建了E6棉纤维专化表达启动子驱动的反义表达载体(E6ASP)；并利用农杆菌介导的遗传转化方法将E6ASP导入棉花W0品系,通过棉花体细胞胚胎发生途径获得转基因植株。对每个再生单株都进行NPTⅡ和启动子-基因特异的PCR检测,经过连续两个世代的选择,获得了11个转基因株系。这些GhPEL的反义转基因株系大多都表现出纤维显著变短的表型,而纤维的强度和细度变化不大。选取其中六个转基因纯合株系进一步分析GhPEL基因在纤维发育中的功能。Southern杂交分析表明,这六个转基因株系都只含一个或两个拷贝；定量RT-PCR和酶活性检测发现,GhPEL在六个转基因株系10-15 DPA纤维中的表达都受到了显著抑制、酶活性显著降低；通过测定棉纤维细胞壁中果胶裂解酶的底物去酯化果胶的含量发现,去酯化果胶在转基因株系的棉纤维中都有显著的积累；这些转基因株系都表现出了纤维不同程度变短的表型。这些结果表明,GhPEL基因在棉纤维伸长期的抑制表达使PEL酶活性降低,影响了纤维细胞壁中去酯化果胶的降解,导致纤维伸长时细胞壁松弛受阻,从而抑制了棉纤维的伸长。GhPEL基因在花粉四分体时期特异表达。用pBI121质粒载体构建了GhPEL的CaMV35S组成性表达启动子驱动的过量表达载体(35SP),用农杆菌介导法将这个表达载体转入棉花W0品系。TO代转基因植株花粉的形态和活力都发生了变异,这可能由于35S启动子驱动GhPEL基因在花粉不同发育时期过量表达,干扰了PEL在花粉中的正常功能,从而使花粉发育受阻。此外,在进行棉花的遗传转化中,发现并培育了两个性状可稳定遗传的突变体株系：一个单拷贝插入的卷叶突变体株系和一个单拷贝插入的矮杆突变体株系,并对其进行了初步分析。这些突变体株系的获得,为棉花形态发育的分子生物学机理研究提供了宝贵的实验材料。此外,用带pBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,建立了农杆菌转化棉花胚性愈伤组织的遗传转化体系,大大提高了转化效率。在对获得的再生植株进行GUS和NPTⅡ基因的PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行GUS基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数；GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,GUS基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而NPTⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达；用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现：GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapⅡ/MspⅠ酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上结果表明,这株GUS沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。