第一部分N6-甲基嘌呤(m6A)在胰腺癌细胞系及组织中表达水平的检测目的:检测m6A在胰腺癌癌组织及癌旁组织中的含量,比较胰腺癌癌组织和癌旁组织中mA6表达丰度的差异。方法:采用比色法定量检测了 21例胰腺癌癌组织及相应癌旁组织,6种胰腺癌细胞系和8例正常胰腺组织中m6A的在总RNA中的表达水平,分析m6A在胰腺癌组织和癌旁组织的表达差异。采用液相色谱法定量检测了 21胰腺癌癌组织及相应癌旁组织,7种胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮细胞中m6A的在mRNA中的表达水平,分析m6A在胰腺癌组织和癌旁组织的表达差异。结果:与正常胰腺组织和人正常胰腺导管上皮细胞相比,胰腺癌癌组织和细胞系中的m6A是高表达的。结论:m6A在胰腺癌中表达丰度是增加的第二部分N6-甲基嘌呤(m6A)甲基转移酶METTL14在胰腺癌组织中的表达与预后目的:检测METTL14在120例胰腺癌病人在胰腺癌中的表达,并结合病人的临床资料,研究METTL14在胰腺癌组织及相应癌旁组织中的表达差异,探讨METTL14表达水平与患者临床资料的相关性。方法:检测METTL14在120例胰腺癌患者的在癌组织和相应癌旁组织中的表达水平,并结合病人的临床资料,分析METTL14的表达量与胰腺癌病人临床分期、病理分级、淋巴结转移和预后的关系。然后,采用real-time PCR和western blot的方法对我院胆胰外科20例胰腺癌组织标本进一步检测和确认METTL14的表达水平。结果:1.与癌旁组织相比较,METTL14在胰腺癌组织中主要呈高表达,差异具有统计学意义(P<0.001)。结合临床病理资料分析显示,METTL14的表达与胰腺癌病人的淋巴结转移相关(P<0.05)。结合随访资料的生存分析显示,METTL14的高表达与胰腺癌病人的预后较差(P<0.05)。2.胰腺癌组织中METTL14基因水平较相应癌旁组织增加。3.胰腺癌组织中METTL14蛋白水平较相应癌旁组织增加(P<00.05)。结论:METTL14在胰腺癌组织多呈高表达,高表达的METTL14胰腺癌病人的淋巴结转移相关,且提示胰腺癌病人较差的预后。第三部分METTL14对胰腺癌增殖和侵袭转移影响的体内外研究目的:本部分使用3种胰腺癌细胞系作为工具,通过构建METTL14下调或过表达的稳转细胞系,研究METTL14干预对胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响。方法:利用慢病毒载体has-METTL14-SH-flag和has-METTL14-flag转染转染人胰腺癌细胞Panc-1、Mia和Bxpc-3后,构建METTL14下调干预或上调干预的稳转细胞系。检测METTL14干预后m6A的变化。通过CCK8、平板克隆实验、transwell和划痕实验,分析METTL14干预后胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力的变化。使用上调和下调METTL14的稳转PANC-1细胞系,构建裸鼠皮下成瘤模型和裸鼠胰腺癌细胞脾脏包膜注射肝转移模型,评价METTL14干预后胰腺癌细胞系在裸鼠体内成瘤能力和侵袭转移能力的差异。结果:1.甲基化酶METTL14可以调控胰腺癌细胞中m6A水平的变化。2.在3种胰腺癌细胞系中下调METTL14,可以显著降低胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移的能力。3.在胰腺癌细胞系中上调METTL14,可以显著增加胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移的能力。4.裸鼠皮下成瘤模型中,下调METTL14表达可以减少皮下成瘤的体积,上调METTL14表达可以增加皮下成瘤的体积相对于阴性对照组,差异有统计学意义。5.上调METTL14的表达,可以促进裸鼠脾包膜注射肝转移模型中肝脏微转移灶的形成,下调METTL14的表达,可以抑制裸鼠脾包膜注射肝转移模型中肝脏微转移灶的形成。和对照组比较,差异具有统计学意义。结论:METTL14可以调控胰腺癌细胞的m6A的变化,METTL14促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移。第四部分METTL14促进胰腺癌增殖和侵袭转移的分子机制研究目的:研究METTL14通过作用于哪条可能的信号通路调控胰腺癌的恶性生物学行为。方法:利用二代测序技术筛选METTL14敲减干预后发生变化的信号通路及差异的miR表达谱,再结合生物信息学的方法,预测调控信号通路的microRNA,筛选出METTL14调控的信号通路所依赖的microRNA。结果:1.METTL14对MAPK通路的激活依赖于Rap1B。2.METTL14可以调控miR-1-3p的表达,而miR-1-3p的靶基因是Rap1B。3.阻断Rap1B可以阻断胰腺癌METTL14对MAPK通路的激活,可以阻断METTL14的促进胰腺癌的增殖和侵袭转移效应。结论:METTL14在胰腺癌细胞中通过抑制miR-1-3p激活MAPK通路而调控胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移。