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目的:尽管经过了一百年的研究,但是结核杆菌感染依然是全世界范围内健康的主要问题,并且是导致人们死亡的主要原因。每年有一千万新的病例被诊断出来,有200万人死于结核。结核的发病率增高和艾滋病人的增加相关连的,而且出现了很多耐药的结核杆菌。通常来说,宿主的免疫系统可以抑制结核杆菌的生长,可以导致潜在的感染,是以在肉芽肿中存活的但不活跃的细菌为特点,世界三分之一的人口有结核的潜在感染,只有百分之十的人发展为活动性肺结核。结核杆菌上的抗原和巨噬细胞和树突状细胞表面的模式识别受体的结合可以导致这些细胞的活化和分泌细胞因子,这些细胞因子可以调节先天免疫应答,并且可以启动获得性免疫。结核菌感染后产生的细胞因子不总是对机体起保护作用,有一些对结核是有益的。IL-12家族中的IL-23是由两个亚基(p40和p19)组成的异源二聚体结构,激活的抗原提呈细胞可以产生IL-23,它对于维持体内的Th17阳性细胞有重要作用,Th17细胞和肿瘤以及炎症相关的疾病有其相关性。本研究首先观察BCG(卡介苗)接种后对相关T细胞亚群的影响,接着探讨抗原提呈细胞在BCG刺激下所产生的促炎和抑炎因子,重点研究了BCG对IL-23的调控机制。通过上述研究可为临床应用奠定分子学基础。方法:1小鼠BMDM(骨髓来源的巨噬细胞)的制备和培养。2 BCG接种C57BL/6小鼠,收集淋巴结细胞检测和感染相关的T细胞亚群。3用ELISA方法检测BCG刺激后BMDM细胞培养上清液中IL-12、IL-6、IL-10、IL-23和IL-1beta的量。4用ELISA方法检测BCG刺激后RAW264.7细胞培养上清液中IL-23的水平。实时定量PCR检测IL-23p19m RNA的表达情况。5针对IL-23p19 DNA设计随机引物,对BCG刺激后RAW264.7细胞做实时定量PCR检测IL-23p19转录前的变化情况。6对RAW264.7细胞用BCG刺激后加入转录抑制剂5-甲基苯并咪唑(dichlorobenzimidazole)+放线菌素D(ACD),阻止新的RNA产生,检测两组各时间点p19m RNA衰变情况。7用免疫印迹法检测被刺激RAW264.7细胞中总p65和磷酸化p65的含量。8用不同浓度的NF-κB信号转导通路阻断剂SN50作用RAW264.7细胞后用BCG刺激,实时定量PCR检测各组p19m RNA水平。9设计质粒转染RAW264.7细胞使其高表达p65,再BCG刺激细胞,通过实时定量PCR检测各组p19m RNA水平。结果:1 C57BL/6小鼠分组给予BCG,用流式细胞技术检测淋巴结中细胞组成。结果发现,BCG导致产生IFN-γ的CD4+T细胞、IL-17的CD4+T细胞数量、IFN-γ的CD8+T细胞数量均有增加。2体外实验显示BCG明显增加小鼠BMDM对IL-12,IL-23,IL-1beta,IL-6和IL-10的分泌。3小鼠巨噬细胞系RAW264.7使用BCG刺激后明显促进IL-23的分泌,使IL-23p19m BNA表达明显增加。4设计含有IL-23p19基因内含子和外显子的引物,通过实时定量PCR检测初级转录产物含量,发现BCG可以在转录水平上促进了IL-23p19表达和降低了IL-23p19m RNA的衰变速度。5 BCG刺激RAW264.7细胞,用免疫印迹法检测出明显提高磷酸化p65的含量,说明NF-κB通路在结核感染中发挥重要作用。6不同含量NF-κB通路阻断剂SN50作用后再用BCG刺激显示p19m RNA的表达明显下降。用对照质粒和NF-κB p65质粒分别转染RAW264.7细胞后使用BCG刺激,实时定量PCR显示高表达NF-κB p65的RAW264.7细胞在受BCG刺激后p19m RNA水平明显升高。结论:1 BCG可以在小鼠中导致产生IFN-γ的CD4+T的升高,同时可以提高产生IFN-γ的CD8+T细胞和Th17细胞的增高。2 BCG刺激可以使BMDM分泌的IL-12、IL-6、IL-10、IL-23和IL-1beta升高。3 BCG对m IL-23p19既可以在转录水平促进改基因的转录,同时抑制该基因的衰变过程。4 BCG诱导NF-κB p65的磷酸化,NF-κB信号通路在BCG诱导m IL-23p19中发挥重要作用。