创伤、肿瘤、感染等原因导致骨折以及骨缺损发生率不断增高,常常需要修复重建。尤其是骨缺损的治疗一直是骨科面临的一个难题。骨缺损的主要治疗方法如自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植等都存在一定的缺陷。随着组织工程的发展,人工骨移植修复骨缺损显示出了更多的优点。胶原是骨的主要成分之一,具有诸多性能:在成熟组织中起结构作用,对发育中组织起定向作用;具有高张力、低延展性、纤维定向性、可控制的交联度;极好的生物相容性、弱甚至无抗原性、植入体内无排异反应、细胞亲和力高、可刺激细胞增殖、分化;体内可降解且可调控降解的速度,降解产物为氨基酸或小肽,可作为组建细胞的原料或通过新陈代谢排出。根据组织工程研究的需要,本研究拟从多种生物原料中制备新型胶原产品。1.从四种生物原料中制备高纯度胶原[目的]从4种生物原料中制备高纯度Ⅰ型胶原,满足骨组织工程应用的需要。[方法]分别以牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱和猪皮为原料,采用酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法经过粉碎、脱钙、脱脂、抽提、盐析,复溶透析等步骤提取胶原,计算提取率。[结果]从四种生物原料中经过上述步骤均可以获得Ⅰ型胶原,超过常规方法。[结论]限制性酶解法可以从四种生物原料中获得较高产量的胶原产品,具有良好的应用前景。2.生物源性胶原成分分析与鉴定[目的]对从4种生物原料中制备的Ⅰ型胶原进行成分分析与鉴定,并与Sigma公司产品进行对比。[方法]采用酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法从牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱和猪皮中提取的Ⅰ型胶原用紫外吸光度、氨基酸分析、SDS-PAGE电泳进行鉴定,计算纯度,同时与Sigma公司产品进行比较。[结果]本法所提胶原的最大紫外光吸收波长为230 nm,氨基酸分析、电泳鉴定符合Ⅰ型胶原特征。牛皮质骨所提胶原纯度最高(96.12%),优于Sigma公司产品。[结论]通过限制性酶解法可以从4种生物原料中制备高纯度Ⅰ型胶原产品,其中以牛皮质骨胶原最好。3.组织工程胶原支架生物特性研究[目的]对提取的高纯度骨胶原作为组织工程支架应用进行细胞相容性和生物降解性的研究。[方法]用提取并经鉴定的高纯度Ⅰ型骨胶原包被玻片同时与骨髓基质干细胞培养,观察细胞粘附率、细胞毒性,并绘制细胞增殖曲线。同时用高纯度Ⅰ型骨胶原制备支架,经过京尼平交联后植入小鼠体内观察生物降解性。[结果]高纯度Ⅰ型骨胶原细胞粘附率高、无细胞毒性、能促进细胞增殖,经过京尼平交联的胶原支架植入小鼠体内后2w左右开始降解,4w时降解完全。[结论]牛皮质骨胶原生物相容性好,生物降解性与骨形成时间相匹配,所制备的胶原适于骨组织工程的应用。以上研究表明酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法可以从牛跟腱、猪跟腱和猪皮中特别是牛皮质骨中提取到高纯度的Ⅰ型胶原,其生物相容性和生物降解性均较适合应用于骨组织工程。