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血细胞和血管的分化与发育是一个十分复杂的过程,其发育过程受一系列因子的精细调控。这些调控因子的突变或表达异常是血液和血管系统疾病发生的内在分子病因。目前对血细胞和血管分化与发育的分子调控机制仍有待深入研究。因此,本论文的目的是研究本实验室早期筛选的候选基因HDCG1在血细胞和血管分化与发育中的作用。本实验室对HDCG1基因的表达研究表明,该基因在血液中高表达,提示HDCG1可能与血细胞的发育有关,但对其在血细胞分化与发育中的作用未知。为了研究该基因调控血细胞发育的生物学作用,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了斑马鱼HDCG1基因的敲除模型,并通过Western blot等实验证明HDCG1基因的敲除模型是有效的。我们进一步通过斑马鱼胚胎整体原位杂交实验、OD染色、苏丹黑染色以及RT-QPCR等实验证明,在HDCG1敲除纯合体中:1)原始造血和定向造血过程中的红系细胞标记gata1的表达水平与血红蛋白基因hbbe1的表达水平显著上调;2)原始造血过程中,髓系标记pu.1和mpo的表达水平几乎不变,但L-plastin的表达水平显著下调,造血干细胞偏髓系细胞标记cmyb和scl的表达水平下调,而造血干细胞标记runx1的表达水平几乎不变;3)定向造血过程中,髓系标记mpo和L-plastin的表达水平轻微下调,淋巴系细胞的标记rag1的表达水平显著上调,造血干细胞标记cmyb、scl和runxl的表达水平下调;4)O-Dianisidine染色结果表明血红蛋白增多,苏丹黑染色结果表明髓系粒细胞数目减少;5)血管内皮标记kdrl和fli1a与体节的标记myod1的表达水平上调;6)前肾组织标记因子cd说17和脊索标记因子shha的表达水平几乎不变,提示HDCG1可能与前肾和脊索的发育无关。上述结果表明HDCG1在斑马鱼的原始造血和定向造血以及血管的发育过程中起着重要的调控作用。为排除胚胎原位杂交等技术研究可能出现的误差,我们利用一系列的血液与血管荧光标记品 系 TG(gata1:dsred),TG(pu.1:EGFP),TG(mpo:EGFP),TG(corola:EGFP),TG(runxl:EGFP),TG(scl:EGFP),TG(cmyb:EGFP),T:G(CD41:EGFP),T:G(fli1 a:EGFP)和 TG(kdrl:mcheriy)分别与HDCG1敲除纯合体杂交,分析敲除HDCG1对血液与血管标记的荧光信号变化影响,研究结果进一步支持利用胚胎原位杂交等技术获得结果的正确性。为了证明上述研究结果确实是由敲除HDCG1基因导致的突变表型,我们合成HDCG1基因mRNA注射到HDCG1突变纯合子胚胎的一细胞期细胞中,研究其是否能拯救HDCG1突变纯合子导致的突变表型。研究结果证明过表达HDCG1确实能使敲除HDCG1导致的突变表型获得拯救。总之,上述实验证明,HDCG1是一个调控斑马鱼的原始造血和定向造血以及血管发育的关键基因。HDCG1调控斑马鱼的原始造血和定向造血以及血管的发育过程的调控机制是什么呢?前人的研究报道wnt16通过与dld/dlc相互作用调控Notch信号途径从而调控造血干细胞的发育,HDCG1基因是不是也和Notch信号途径有关呢?我们用原位杂交实验检测了 Notch信号途径相关的分子的表达情况,结果显示在HDCG1纯合突变体中,wnt19,dld和dlc的表达水平上调,提示HDCG1基因可能通过Notch信号途径调控造血干细胞的分化与发育。为了深入研究HDCG1基因是否还通过其他信号通路调控造血干细胞的分化与发育,我们利用敲除HDCG1基因纯合突变体研究全转录组的表达情况,选取24hpf时期的纯合突变体胚胎送去公司做转录组测序,HDCG1纯合突变体胚胎和WT胚胎组各做三个重复。测序结果分析表明,Notch信号途径的相关因子的表达受到不同程度的影响,其结果与胚胎原位杂交获得的结果相同。此外,测序结果还表明:Wnt信号途径、Jak-Stat信号途径、Fgf信号途径、Tgfβ信号途径以及血液血管血红蛋白相关因子的表达也受到不同程度的影响。为了验证转录组测序的结果,我们选择部分基因做了 QRT-PCR分析,实验结果与全转录组测序得到了一致的结果,这说明HDCG1能影响多条信号通路以及和血液血管发育相关的基因的表达。为了鉴定HDCG1调控的直接靶基因,我们选择野生型胚胎做了ChIP实验,并将最后纯化回收的总染色质送去公司进行全基因组的ChIP-Seq分析。分析结果表明,HDCG1可以结合在75个基因的promoter 上,其中 14 个基因egfl6、igsf8、slc25af8、ism1、kmt2a、st6galnac2、phkg1a、smfn、chst1、stat5b、cenpk、aggf1、uvrag 和 fam210b与血液血管的发育相关。为了验证ChIP-Seq的结果,我们做了ChIP-PCR分析,ChIP-QPCR实验得到的结果与ChIP-Seq结果一致。我们进一步比较转录组测序与ChIP-Seq结果,筛选到其表达有显著改变的基因与ChIP-Seq结果相吻合的5个候选靶基因:egf16、igsf8、stat5b、aggf1和ism1,我们对这五个候选靶基因用RT-PCR和QRT-PCR进行表达分析,结果表明aggf1和igsf8基因在HDCG1纯合突变体中的表达水平显著上调,ism1、stat5b和egf16基因在HDCG1纯合突变体中的表达水平显著下调,与转录组测序的结果一致。Agf1被认为是最早调控造血干细胞分化发育的因子,在中胚层分化成成血管细胞(将来发育成造血干细胞和血管细胞)这一过程发挥作用,提示aggf1可能是HDCG1的直接靶基因,HDCG1可能是一个比aggf1还位于更早期阶段的调控造血干细胞分化发育的因子;大量研究表明,stat5b是调控造血发生的主控基因,且其与许多恶性血液疾病的发生有关,我们的ChIP分析结果表明,stat5b可能是HDCG1的直接靶基因。因此,本课题接着将着重研究HDCG1如何通过aggf1和stat5b调控血细胞分化发育的分子调控机制。阐明其机制将有助于完善脊椎动物与人类血细胞分化发育调控机制的理论,为血液血管相关疾病的治疗提供可能的治疗靶点。