宫颈癌(cervical cancer)是全世界女性居第二位的生殖道恶性肿瘤,其发病率和死亡率在妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌。每年,我国都有大量新发现宫颈癌病例,数量约为13万,占全世界新发现病例的1/3,每年宫颈癌死亡病例约为5.3万,居世界第二位。宫颈癌发生与流行和众多因素有关,其中年龄是因素之一,宫颈癌患者在20-50岁之间增长迅速,其后速度减慢。宫颈原位癌的年龄高峰大概在40-44之间,宫颈浸润癌的年龄高峰在45-54之间,近年来,宫颈癌发病有年轻化及发病年龄段前移的趋势。其次,民族,地区,职业,社会经济状况等都对宫颈癌的流行产生影响。对于宫颈癌发病的高危因素国内外已经有大量的研究报道,如HPV感染、性行为、机体免疫功能、社会经济地位、孕产史、疱疹病毒Ⅱ型以及食物、吸烟和遗传易感性等,这些因素既能单独作用,也可相互协同作用。与其他恶性肿瘤相比,如果早期发现,宫颈癌的预后相对较好,但由于宫颈癌发病的隐匿性,很多未做筛查的病患一经发现就到达晚期。宫颈癌变多发生于宫颈细胞鳞柱交界区,癌细胞突破基底膜就会向深层组织甚至周围器官扩散。肿瘤的浸润和转移往往与上皮间质化(epithelial-mesenchymal transitionEMT)相关。EMT是一个多阶段、多步骤的上皮细胞形态变化的过程,在此过程中,上皮样特性逐渐降低,间质化特性逐渐增强。上皮细胞失去极性,细胞间连接丢失,逐渐转化为具有迁移浸润能力的间质细胞。具有EMT特征的肿瘤的转移是以E-cadherin的表达降低, N-cadherin vimentin等间质分子的表达增高为特征。同时Snail等转录因子的表达增强。EMT的发生与多种肿瘤的浸润和转移有密切的联系。目前,宫颈癌细胞是如何获得迁移和浸润的能力而达到远处转移,EMT与宫颈癌的转移有怎样的关系还有待于进一步研究。星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1, AEG-1)是2002年期间,Su等发现,逐渐受到广泛深入研究的新基因,也称为(转移黏附蛋白)异黏蛋白(metadherin, MTDH),3D3和LYRIC分别为其在小鼠和大鼠中的同源蛋白分子。AEG-1/MTDH基因定位于8q22区,由12个外显子和11个内含子组成。AEG-1/MTDH是由582氨基酸编码构成的蛋白,其氨基酸序列在脊椎动物中高度保守。近年来的研究表明,AEG-1/MTDH在多种肿瘤中高表达,诸如前列腺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、肝癌、食管鳞状细胞癌、胃癌和非小细胞肺癌,并且与疾病的发展和不良的临床预后有关。研究还发现／AEG-1/MTDH能促进肿瘤的转移、浸润、化疗抗性和血管生成。但是,AEG-1/MTDH在宫颈癌中的表达情况还未见报道,它与EMT之间有何关联,因此本课题将研究AEG-1和E-cadherin在宫颈癌中的表达情况,了解两者之间的相关性,掌握它们对宫颈癌的影响。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过体内的或体外人工合成的双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)在细胞内特异性降解其同源mRNA,从而抑制目的基因的表达。是一种转录后沉默现象。在研究基因功能时,它是重要的工具。RNA干扰已被应用于肿瘤、病毒感染等基因治疗的研究中。用慢病毒(Lentivirus)做载体目前使用率较高,它介导RNAi比其他病毒载体系统更高效、更有特异性。慢病毒既能转导分裂细胞,也能转导非分裂(Non-dividing)细胞,而且将所需shRNA整合进入宿主细胞基因组,从而实现目的基因的稳定沉默。在我们的实验中,准备使用RNA干扰技术损坏宫颈癌细胞AEG-1/MTDH mRNA,降低宫颈癌细胞AEG-1/MTDH蛋白的合成,从而下调AEG-1/MTDH对下游基因的转录调控,从而阻断肿瘤细胞的AEG-1/MTDH的表达,或使肿瘤细胞的AEG-1/MTDH的表达降到最低,而达到抑制AEG-1/MTDH促进肿瘤浸润和转移以及增殖的目的,提高宫颈癌的治疗效果。在本研究中,首先深入了解AEG-1/MTDH在宫颈癌中的表达情况,进而采用慢病毒介导的RNAi,建立AEG-1/MTDH基因稳定沉默的宫颈癌Hela细胞株,验证AEG-1/MTDH基因沉默的效果,并且通过与对照组细胞的比较,来观察下调AEG-1/MTDH蛋白对EMT相关标志分子、细胞增殖、细胞侵袭和化疗敏感性的影响,从而分析判断AEG-1/MTDH在肿瘤细胞发生EMT中的作用,和它对肿瘤细胞的一些生物特性,比如增殖、侵袭和化疗敏感性中所起的作用,以及与肿瘤干细胞的关系,借此希望能为临床应用提供帮助。第一部分AEG-1/MTDH和E-cadher in在宫颈癌组织上的表达和相互的关系1.目的(1)检测AEG-1/MTDH、E-cadherin在宫颈癌中的表达(2)研究／E-cadherin的表达与宫颈癌临床病理参数的关系,以及两者之间的关联性。2.材料与方法(1)收集兰州大学第一医院病理科宫颈癌石蜡包埋样本,CIN6例,宫颈癌52例,病人临床分期可通过追踪病历获得。收集甘肃省人民医院、兰州市妇幼保健院妇产科宫颈癌新鲜临床样本10例。(2)研究AEG-1/MTDH、E-cadherin在宫颈癌中的表达：免疫组织化学法、Western Blot分析3.结果(1)AEG-1在宫颈癌组织中是高表达的,71.2%(37/52例)标本为阳性表达。(2)对宫颈癌患者的临床资料进行χ2检验,研究AEG-1、E-cadherin在不同临床分期、组织学分级之间有无显著性差异。在疾病早期(Ⅰ+Ⅱ)患者中AEG-1阳性率为65.1%(28/43),疾病晚期(Ⅲ+Ⅳ)患者中AEG-1阳性率为100%(9/9),二者相比有显著性差异(P=0.046)；在高分化患者中AEG-1的阳性率为55.6%(15/27),低分化患者AEG-1的阳性率为88%(22/25),二者相比有显著性差异(P=0.014)；在疾病早期(Ⅰ+Ⅱ)患者中E-cadherin的阳性率为88.4%(38/43),疾病晚期(Ⅲ+Ⅳ)患者中E-cadherin的阳性率为33.3%(3/9),二者之间有显著性差异(P=0.001),在高分化患者中E-cadherin的阳性率为92.6%(25/27),低分化患者E-cadherin的阳性率为64%(16/25),二者之间有显著性差异(P=0.017)。(3)AEG-1随着临床分期的加深、细胞分化的降低而表达增加,E-cadherin随着临床分期的加深、细胞分化的降低而表达减弱,尤其是晚期,Spearman相关性分析(r=-0.707,P=0.009)AEG-1与E-cadherin表达之间呈负相关。(4)通过Western Blot分析宫颈癌新鲜手术样本,发现低分化组织AEG-1表达较高分化组织增高,AEG-1降低的组织E-cadherin增高。4.结论(1)AEG-1在宫颈癌组织中是高表达的,71.2%(37/52例)标本为阳性表达(2)AEG-1和E-cadherin在不同的分期和组织学分级的表达有显著性差异。(3)AEG-1与E-cadherin在一定程度上呈负相关。第二部分慢病毒介导的AEG-1/MTDH基因沉默对宫颈癌HeLa细胞的影响1.目的(1)筛选AEG-1/MTDH基因沉默的细胞株(2)比较AEG-1/MTDH基因沉默的效果(3)观察AEG-1/MTDH基因沉默对肿瘤细胞EMT分子标记的影响(4)研究AEG-1/MTDH基因沉默对肿瘤细胞迁移能力的影响(5)分析AEG-1/MTDH基因沉默对肿瘤细胞侵袭能力的影响(6)观察AEG-1/MTDH基因沉默对肿瘤细胞克隆形成能力的影响(7)研究AEG-1/MTDH基因沉默对肿瘤细胞化疗敏感性的影响(8)分析AEG-1/MTDH基因沉默后NF-κB p65蛋白表达的改变2.方法(1)RNA干扰慢病毒的生产：三质粒共转染293T细胞生产病毒(2)基因沉默细胞株的筛选：慢病毒转染HeLa细胞后,用嘌呤霉素筛选,建立AEG-1/MTDH基因沉默细胞株和对照细胞株(3)用定量RT-PCR法测定AEG-1/MTDHmRNA表达水平(4)用Western Blot分析AEG-1/MTDH在各株细胞上的蛋白表达水平(5)用Western Blot分析EMT各分子、NF-κB p65在不同细胞株上的蛋白表达水平(6)采用划痕实验测定肿瘤细胞的迁移能力(7)采用Tanswell侵袭实验测定肿瘤细胞的浸润能力(8)使用平板克隆和软琼脂克隆测定肿瘤细胞增殖能力(9)使用MTT和软琼脂药物暴露实验测定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性3.结果(1)成功筛选出HeLa-AEG-1shRNAl, HeLa-AEG-1shRNA2,同时还有对照shRNA vector稳定细胞株(2) HeLa-AEG-1shRNAl,HeLa-AEG-1shRNA2的AEG-1/MTDH mRNA水平下降；HeLa-AEG-1shRNAl, HeLa-AEG-1shRNA2的蛋白水平与对照组相比也下降约90%。(3)在EMT相关标记分子的表达上,AEG-1shRNAl组较之shRNA vector组有变化：N-cadherin表达下降,Vimentin、Snail表达显著下降,E-cadherin表达变化不大。而AEG-1shRNA2组与对照组相比无明显变化。后续试验则以AEG-1shRNAl组作为实验组,标记为AEG-1shRNA。(4)在划痕试验中,24小时迁移率AEG-1shRNA组为11%,shRNA vector组为26%,P<0.05；48小时迁移率AEG-1shRNA组为22%,shRNA vector组为29%,无显著性差别。Tanswell侵袭实验中,48小时AEG-1shRNA组细胞穿膜数为284.25±39.9,shRNA vector组细胞穿膜数为525.4±83.7,P<0.01,具有显著性差异。(5)细胞增殖实验显示,每5000个细胞,AEG-1shRNA组形成CFU45±11.1个,shRNA vector组形成CFU102±17.2个,P=0.05。(6)药物敏感试验显示,软琼脂中5000个细胞AEG-1shRNA组形成CFU7.33±0.88, shRNA vector组形成CFU169.6±34.4,P<0.01,Cisplatin(5μM); AEG-1shRNA组形成CFU2.66±0.88,shRNA vector组形成CFU26.6±6.7, P<0.05, Paclitaxel(2.5nM)。(7)NF-κB p65蛋白表达AEG-1shRNA组低于shRNA vector组。4.结论当宫颈癌HeLa细胞中AEG-1降低后,上皮间质化水平降低,NF-κB p65含量下降,细胞迁移和侵袭能力降低,克隆形成率降低,对化疗药物的敏感性增强。