微拟球藻是一种海洋单细胞微藻,可以作为光合细胞工厂,在生物燃料、高附加值产品生产等领域具有较大的应用价值。藻细胞在受到高光胁迫时会产生过量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成细胞氧损伤,导致细胞生长速率降低,并影响不饱和脂肪酸的积累。利用基因工程手段对野生型微藻进行改造,可以提高其抗逆性。本研究以微拟球藻Nannochloropsis oceanica IMET1为研究对象,筛选了高表达启动子,对外源透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)进行表达;另外,对内源胞质型丙酮酸磷酸双激酶基因(cytoplasmic pyruvate orthophosphate dikinase,cyPPDK)进行过表达,取得如下结果:(1)基于转录组测序结果的分析,通过与微拟球藻常用启动子α-tubulin和β-tubulin对应基因进行比较,选择3个组成型高表达基因LHC(light-harvesting protein),HSP20(heat shock protein)和RPL32(ribosomal protein l32)5’端上游的1000 bp片段作为微拟球藻启动子。以绿色荧光蛋白基因GFP作为报告基因,构建表达载体。通过电转化的方式电转入微拟球藻细胞体内,得到含有不同启动子的转化株。荧光显微镜观察GFP的绿色荧光,结果表明3个启动子均实现GFP蛋白的表达。实时荧光定量PCR结果表明RPL32,LHC和HSP20启动子诱导的GFP基因表达量分别为内参基因Actin表达量的1.15,5.46和6.58倍。LHC和HSP20启动子可以作为微拟球藻新的高效启动子。这为微拟球藻基因工程提供了新的启动子元件。(2)将LHC启动子与LHC基因的叶绿体信号肽片段融合,对透明颤菌血红蛋白进行叶绿体内表达。CO-差示光谱结果证明转化株中血红蛋白具有正常的功能活性。高光胁迫条件下,同野生型藻株相比,转化株的生长速率提高了24%,EPA含量提高了34%,并且光合参数Fv/Fm显著高于野生型。证实VHb蛋白在微藻受高光胁迫时能够减少氧化损伤,降低光呼吸作用,进而促进微藻生长与不饱和脂肪酸的积累。(3)以HSP20作为启动子,诱导微拟球藻cyPPDK基因进行过表达。PCR结果显示过表达载体成功电转入微拟球藻细胞内,且传代培养12代后,抗性基因未丢失。RT-PCR分析结果表明,转化株类C4途径相关基因的表达量同野生型藻株相比上调。另外,转化株的油脂含量比野生型藻株高32%。初步研究结果表明cyPPDK对促进微拟球藻类C4循环,平衡物质与能量代谢具有重要作用。